家族性原发性皮肤淀粉样变一家系的OSMR基因突变检测

周云 曹先伟 许桂文 吴红宣 郭竹秀 陈丽

家族性原发性皮肤淀粉样变一家系的OSMR基因突变检测

周云 曹先伟 许桂文 吴红宣 郭竹秀 陈丽

目的检测家族性原发性皮肤淀粉样变一家系患者的OSMR基因突变情况。方法收集一家族性皮肤淀粉样变家系临床资料,提取先证者及其19名相关亲属、50例无关健康对照外周血DNA,采用PCR扩增OSMR基因编码区的全部外显子及其侧翼序列并测序。结果基因检测发现,先证者OSMR基因发生c.2081C＞T杂合突变,导致氨基酸出现p.P694L改变,家族中其他患者均发现同样突变位点,而家族健康成员及健康对照组均未检出此突变。结论OSMR基因的p.P694L突变可能是导致患者出现皮肤淀粉样变临床表型的病因。

淀粉样变,家族性;OSMR基因;突变,误义

皮肤淀粉样变(PCA)是一种慢性瘙痒性皮肤病,大多数为散发病例,约10%有显性遗传家族史［1］。家族性原发性皮肤淀粉样变(FPCA,OMIM 105250)一般在青春期前后起病,通常表现为胫前瘙痒,可见色素沉着及皮肤增厚或苔藓样变,可逐渐向身体其他部位蔓延,皮损可因慢性搔抓和摩擦等慢性损伤而加重。目前认为FPCA的发病为第5号染色体上编码细胞因子制瘤素M 特异性受体 β(oncostatin M-specific receptor β,OSMRβ)的基因OSMR突变所致［1］。我们对一个FPCA家系进行OSMR基因突变检测。

一、检测对象

先证者(Ⅲ13)男,46岁,18岁时双胫前对称散在米粒大小褐色斑丘疹,后逐渐形成隆起的丘疹,伴有明显瘙痒感。丘疹逐渐增大并增多,针头至米粒大小,呈多角形或不规则形,棕褐色,密集成片但不融合,周边可见少许褐色斑疹。皮损处皮肤较干燥且粗糙,表面可见少许鳞屑,有较多黑色角栓,伴有抓痕和血痂。家族中其他受累成员发病年龄为5～25岁(图1),主要表现为皮肤苔藓样变,亦可见斑状皮损。典型表现为开始于小腿的少量轻度苔藓样变丘疹伴轻微色素沉着,家系中大部分患者逐渐发展为局限于小腿的不同程度的以苔藓样变为主的皮损,并伴有不同程度的瘙痒(图2a)。对照组50例为与此家系无血缘关系且无皮肤淀粉样变的健康人。

图1 原发性皮肤淀粉样变家图 *:采血并做了基因检测

二、方法

1.组织病理学检查:取先证者胫前丘疹性皮损行HE染色和刚果红染色。

2.DNA提取:分别抽取先证者、19例家庭成员及50例健康对照外周血2 ml,2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝,以低渗溶血以及酚-氯仿抽提法提取DNA。

3.PCR引物设计:根据OSMR基因序列(来源于http://www.ensembl.org/index.html),利用 Primer3在线版(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)设计18对特异性引物扩增先证者OSMR基因编码区18个外显子及其侧翼序列,引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

图2 原发性皮肤淀粉样变的临床及病理特征 2a:患者胫前多角形丘疹,棕褐色,密集成片但不融合,表面可见少许鳞屑、皮肤粗糙干燥,顶端多见黑色角栓;2b:刚果红染色显示真皮乳头层无定形的阳性团块(×40)

图3 原发性皮肤淀粉样变患者基因测序结果 3a:先证者c.2081C＞T杂合突变测序图,家族中其他患者测序结果与先证者相同;3b:家系中未受累成员及50例健康对照的该位点测序图

4.PCR反应体系及条件:PCR反应体系25 μl,含基因组DNA 50 ng,dNTPs 0.4 mmol/L,MgCl22.0 mmol/L,上下游引物各10 μmol/L,Taq DNA聚合酶2.5 U。反应条件:95℃预变性5 min后,进行以下10个循环:94℃变性30 s,62℃退火30 s(每个循环后退火温度降低0.5℃),72℃延伸45 s,接着进行35个循环:94℃变性30 s,57℃退火30 s,72℃延伸45 s,共45个循环,最后72℃延伸9 min,DNA扩增在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR扩增仪上进行。所有PCR产物纯化后送至北京天一辉远生物科技有限公司测序。

三、结果

HE染色示表皮轻度角化过度,棘层肥厚,真皮乳头层内见大小不一的团块状嗜伊红性淀粉样物质沉积,刚果红染色阳性(图2b)。以先证者基因组DNA为模板,所有18对引物在各自的条件下分别扩增出各自产物,包括所有外显子的编码序列以及两端至少60 bp的侧翼序列。所有产物纯化后测序结果与Ensembl网站所公布的序列进行对照发现,先证者OSMR基因15号外显子第2 081位核苷酸(从cDNA编码起始位点ATG算起)发生C→T杂合错义突变(c.2081C＞T),见图3a。导致第694号编码氨基酸发生脯氨酸到亮氨酸(p.P694L)改变,突变来自母亲。先证者母亲及其他受累亲属均发生同样突变,而未受累成员及50例健康对照均未见该突变(图3b)。

四、讨论

FPCA是一种常染色体显性遗传性皮肤病。2006 年,Lee 等［2］应用全基因组扫描等方法将FPCA的致病基因定位于 5p13.1-q11.2。 2008 年,Arita 等［1］应用微卫星连锁分析法确定本病的致病基因为OSMR。OSMR基因编码的跨膜蛋白OSMRβ是制瘤素M Ⅱ型受体［3］和白介素31受体［4］的重要组成部分,OSMRβ和gp130结合组成制瘤素MⅡ型受体,OSMRβ与IL31RA结合组成白介素31受体,这两种受体均属于IL-6细胞因子受体家族成员［3］。位于OSMRβ分子上的Ⅲ型纤连蛋白(FNⅢ)结构对OSMRβ与其相应受体亚单位的二聚化过程起到重要的作用［5］。本研究报道的突变氨基酸p.P694L位于 OSMRβ 分子上的 FNⅢ重复区域［6］。 Lin 等［6］通过对 29 个FPCA家系的基因研究发现,其中一个家系的IL31RA基因发生杂合错义突变(c.1562C＞T),导致氨基酸发生p.S521F改变,可能也与本病发生有关。IL31RA基因也位于5号染色体,其编码的IL31RA与OSMRβ结合形成IL-31受体。Lin等［6］推测此突变也是通过影响皮肤相应的信号通路而引起FPCA的发生。

［1］Arita K，South AP，Hans-Filho G，et al.Oncostatin M receptorbeta mutations underlie familial primary localized cutaneous amyloidosis［J］.Am J Hum Genet，2008，82(1):73-80.

［2］Lee DD，Lin MW，Chen IC，et al.Genome-wide scan identifies a susceptibility locus for familial primary cutaneous amyloidosis on chromosome 5p13.1-q11.2 ［J］.Br J Dermatol，2006，155(6):1201-1208.

［3］Heinrich PC，Behrmann I，Haan S，et al.Principles of interleukin(IL)-6-type cytokine signalling and its regulation［J］.Biochem J，2003，374(Pt 1):1-20.

［4］Hofstra RM，Sijmons RH，Stelwagen T，et al.RET mutation screening in familial cutaneous lichen amyloidosis and in skin amyloidosis associated with multiple endocrine neoplasia［J］.J Invest Dermatol，1996，107(2):215-218.

［5］Kurth I，Horsten U，Pflanz S，et al.Importance of the membraneproximal extracellular domains for activation ofthesignal transducer glycoprotein 130［J］.J Immunol，2000，164(1):273-282.

［6］Lin MW，Lee DD，Liu TT，et al.Novel IL31RA gene mutation and ancestral OSMR mutant allele in familial primary cutaneous amyloidosis［J］.Eur J Hum Genet，2009，18(1):26-32.

Mutation analysis of the OSMR gene in a family with familial primary cutaneous amyloidosis

Zhou Yun*，Cao Xianwei，Xu Guiwen，Wu Hongxuan，Guo Zhuxiu，Chen Li.*Department of Dermatology，First Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

Cao Xianwei，Email:ndyfyygk@163.com

Objective To identify mutations in the OSMR gene in a pedigree with familial primary cutaneous amyloidosis(FPCA).Methods Clinical data were collected from a pedigree with FPCA.Peripheral blood samples were obtained from the proband，his 19 relatives，and 50 unrelated healthy human controls.Genomic DNA was extracted from these blood samples，and subjected to PCR for the amplification of 18 encoding exons and their flanking sequences of the OSMR gene followed by DNA sequencing.Results A heterozygous missense mutation c.2081C ＞ T，which leads to the substitution of proline by threonine at position 694，was detected in the OSMR gene of the proband and his affected relatives，but not in unaffected relatives or healthy controls.Conclusion The heterozygous mutation p.P694L in the OSMR gene may cause the clinical phenotype of FPCA in this family.

Amyloidosis，familial；Gene，OSMR；Mutation，missense

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.08.017

330006南昌大学第一附属医院皮肤科(周云、曹先伟、吴红宣、郭竹秀、陈丽);青岛大学医学院附属医院皮肤科(许桂文)

曹先伟,Email:ndyfyygk@163.com

2013-07-24)

(本文编辑:尚淑贤)