纤维素酶及耐高温淀粉酶提取柑橘皮果胶的研究

王文文，李静，邓毛程，汤敬谦，张东峰

（1.广东轻工职业技术学院，广东广州510300；2.广东高校特色调味品工程技术开发中心，广东广州510300；3.暨南大学图书馆，广东广州510632）

果胶是一种高分子碳水化合物，是细胞壁的一种组成成分，广泛存在于植物的果实、根、茎、叶中。由于果胶是天然提取物，无毒无害，安全可靠，所以经常作为胶凝剂、增稠剂、稳定剂、乳化剂、组织改良剂等天然食品添加剂应用在食品及化工工业中[1]。此外，由于果胶具有抗菌、止血、消肿、解毒、止泻、降血压、抗辐射等作用，近年来，其在医药领域的应用也较为广泛[2-3]。随着功能性多糖的开发研究，果胶作为水溶性膳食纤维，越来越受到研究和加工行业的重视。

柑橘为我国著名果品之一，柑橘皮中果胶含量约占20%～30%。从柑橘皮中提取的果胶是高酯化度的果胶，酯化度在70%以上，提取的果胶不仅安全优质而且是对柑橘皮的“废物利用”，不仅可解决废物处理问题，还可提高柑橘生产加工的经济效益，是柑橘综合利用的很好途径[4-6]。

据目前文献报道，果胶提取方法多为单纯酸水解法或单纯酶法提取[1]，综合运用双酶法提取鲜见报道。因此本研究对纤维素酶及耐高温淀粉酶辅助提取柑橘皮果胶工艺进行研究。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

柑橘皮粉：柑橘购自水果市场，剥下柑橘皮晒干，干柑橘皮用粉碎机粉碎，过100目筛，得柑橘皮粉。

纤维素酶购自南宁庞博生物工程公司，酶活力为 10000 U/g；耐高温淀粉酶购自诺维信公司，酶活力为 20000 U/g。

咔唑试剂，无水乙醇，半乳糖醛酸，氢氧化钠，浓盐酸，浓硫酸均为分析纯。

1.2 主要仪器和设备

DMF-10A型摇摆式高速中药粉碎机：广州市旭郎机械设备有限公司；DK-S26型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；S22PC型分光光度计：上海凌光技术有限公司；中佳-SC-3614低速离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；BSA-224S-CW电子分析天平：北京塞多利斯天平有限公司；PHS-3C雷磁酸度计：上海雷磁仪器厂，玻璃比色皿等。

1.3 方法

1.3.1 样品的制备

将鲜柑橘皮自然风干，切碎片，旋风式微型高速样品粉碎机粉碎，过100目筛，备用。

1.3.2 酶量对柑橘皮果胶提取的影响

配制料液比为1∶15的果胶液，在pH 4.8，温度50 ℃条件下，按照 10、20、30、40、50 U/g的量分别加入纤维素酶和耐高温淀粉，酶解3.0 h，确定最佳酶量。

1.3.3 时间对复合酶提取柑橘皮果胶的影响

配制料液比为1∶15的果胶液，在上述优化的最佳酶使用量下，调pH4.8，温度50℃酶解不同时间，确定最佳作用时间。

1.3.4 pH对复合酶提取柑橘皮果胶的影响

配制料液比为1∶15的果胶液，在上述优化的酶加量下及时间下，温度50℃，调不同pH，确定最佳pH。

1.3.5 温度对复合酶提取柑橘皮果胶的影响

配制料液比为1∶15的果胶液，在上述优化的酶加量、时间及温度下，设置不同温度，确定最佳温度。

1.3.6 正交试验设计

以单因素试验结果为基础，选出提取加酶量、pH、提取时间、温度4个因素，设计L9（34）正交试验进行试验，确定复合酶的最佳提取工艺条件，试验设计见表1。

表1 优化提取因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for extraction

1.3.7 柑橘皮果胶提取率测定

1.3.7.1 果胶咔唑比色法测定

果胶经水解生成半乳糖醛酸，在强酸中与咔唑试剂发生缩合反应，生成紫红色化合物，其呈色强度与半乳糖醛酸含量成正比[7]。参考文献[8]的方法，以半乳糖醛酸标准品为标样制备标准曲线，咔唑-硫酸分光光度法测定。测定标准曲线方程为：A=0. 0068C+0.007

式中：A为吸光值；C为半乳糖醛酸浓度，（μg/mL），r=0. 9988。

1.3.7.2 柑橘皮果胶粗提率

果胶粗提取率（%）=柑橘皮果胶的质量（以半乳糖醛酸计，g）/原料的质量（g）× 100%

2 结果与分析

2.1 复合酶加量对柑橘皮果胶提取的影响

复合酶使用量是提取过程中的重要因素，酶量过多或过少都会影响提取效果。酶加量对复合酶提取柑橘皮果胶的影响见图1。

图1 酶加量对复合酶提取果胶的影响Fig.1 Effect of enzyme concentration on the compound enzyme extraction rate of pectin

由图1可知，在一定范围内，随着加酶量的提高，果胶的提取率逐渐增高，但超过一定用量后，即使再增加酶用量，果胶提取率变化不大。这是由于酶有最佳作用浓度，超过浓度，只会增加生产成本，因此确定加酶量为40 U/g。

2.2 pH对复合酶提取柑橘皮果胶的影响

根据2.1的结果，确定加酶量40 U/g，温度45℃，时间3.0 h，研究不同pH对复合酶提取柑橘皮果胶的影响。pH对复合酶提取柑橘皮果胶的影响见图2。

图2 pH对复合酶提取果胶的影响Fig.2 Effect of pH on the compound enzyme extraction rate of pectin

结果表明（如图2所示），在pH低于5时，随着pH的增加，果胶提取率逐渐增加，但pH超过5，果胶提取率开始下降，这主要是pH影响了酶发挥作用，因此确定复合酶的最佳pH为5。

2.3 温度对复合酶提取柑橘皮果胶的影响

根据2.1及2.2的结果，确定加酶量40 U/g，pH 5，时间3.0 h，研究不同处理温度对复合酶提取柑橘皮果胶的影响。温度对复合酶提取柑橘皮果胶的影响见图3。

图3 温度对复合酶提取果胶的影响Fig.3 Effect of temperature on the compound enzyme extraction rate of pectin

由图3可知，温度为50℃时，提取效果最佳。温度低于或高于50℃都会降低复合酶的提取效率，温度过高，会抑制酶活，甚至破坏酶结构，温度过低，不能使酶发挥最大活力效应，从而使提取效果下降。

2.4 时间对复合酶酶提取柑橘皮果胶的影响

根据上述结果，确定加酶量40 U/g，pH 5，温度50℃。研究不同时间对复合酶提取柑橘皮果胶的影响。时间对复合酶提取柑橘皮果胶的影响见图4。

图4 时间对复合酶提取果胶的影响Fig.4 Effect of time on the compound enzyme extraction rate of pectin

图4结果表明，时间3.0 h时果胶提取率最高。当处理时间低于3.0 h时，复合酶的活力没有得到充分利用，果胶不能很好的溶出，当时间高于3 h，果胶提取率反而降低，可能因为酶活降低，以及果胶结构发生变化所致，故3.0 h为最佳的提取时间。

以单因素试验结果为基础，选出提取加酶量、pH、提取时间、温度4个因素，设计L9（34）正交试验进行试验。复合酶提取柑橘皮果胶正交试验结果见表2和表3。

由表2和表3可以看出，影响因素依次为B＞D＞A＞C，即B在0.05水平下显著。由此确定最佳提取工艺为：A3B2C1D3，即在料液比为 1∶15 时，酶用量为 45 U/g，处理时间3.0 h，提取温度为55℃，pH为4.8。在最佳条件下进行验证试验3次平均提取率为36.48%。

表2 正交试验结果分析Table 2 Analysis on the results of orthogonal experiment

表3 正交试验方差分析表Table 3 The results of variance analysis for orthogonal experiment

3 结论

本研究的主要目的是对现有的柑橘皮果胶提取各工艺进行改进以提高柑橘果胶的提取率和产品质量。其改进主要表现在以下两个方面：（1）在提取之前对柑橘皮原料进行粉碎处理，以增加酶作用面积。（2）纤维素酶酶解提取与耐高温淀粉酶酶解提取综合运用，以增加提取率和提取纯度。

采用纤维素酶与耐高温淀粉酶对柑橘皮果胶进行提取，选用料液比为1∶15，在单因素试验的基础上，通过正交试验，确定最佳提取工艺条件为：复合酶量45 U/g，时间 3.0 h，温度 55℃，pH 为 4.8，在此条件下，柑橘皮果胶提取率可达36.48%。

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