HPLC法同时测定养血安神片中梓醇与毛蕊花糖苷的含量

许 永，赵 成

(1.安徽省六安市中医院;2.安徽省六安市食品药品检验所，安徽 六安 237000)

养血安神片的主要由地黄、熟地黄、仙鹤草、鸡血藤、墨旱莲、合欢皮、首乌藤等中药组成，具有滋阴养血，宁心安神的功效。临床用于治疗阴虚血少、头眩心悸、失眠健忘。其中地黄具有清热凉血，养阴，生津的作用;熟地黄更有益精补髓、滋阴养血的功效［1］，是方中的君味，主要含有环稀醚萜苷类如梓醇、毛蕊花糖苷、地黄苷 A，B，C，D、单蜜力特甙、和双氢梓醇等成分。养血安神片现用质量标准仍按1993年卫生部药品标准中药成方制剂第八册进行检验，标准中对可控性强的含量数据未作研究，查相关资料也未有报道。文中笔者选择成分中水溶性核苷成分——毛蕊花糖苷以及梓醇作为定量标准［2－3］，通过采用高效液相色谱法来实现成分含量的测定，以求从多方面控制养血安神片的治疗质量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 检测实验中使用到的仪器为Agilent 1000高效液相色谱仪，其中具体配件包括有在线脱气机、四元泵、柱温箱、VWD紫外检测器、自动进样器以及色谱工作站。梅特勒电子天平XP6U(精密度:0.0001 mg)。

1.2 实验试剂 实验中用到的试剂主要有乙腈色谱纯、自制纯化水、甲醇色谱纯以及色谱用磷酸等。

1.3 实验药品 试验中毛蕊花糖苷对照品购于为中国国家药品生物制品鉴定所，其批号为110520－201020;梓醇购于为中国国家药品生物制品鉴定所，其批号为110808－201108。养血安神片为市场随机购买(山西亚宝药业集团股份有限公司生产，批号:120712、120806、120921)。

2 方法

2.1 测定色谱条件选择以及系统适应性实验 色谱柱为AgilentSB-AQ，其参数为(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流速控制在 1.0 mL·min－1，检测波长为210 nm，柱温保持30℃。流动相0.1%磷酸溶液－乙腈:0 ～14.00 min(1%乙腈)，14.01 ～36.00 min(20%乙腈)。理论塔板数按毛蕊花糖苷峰不低于3 000，而梓醇峰不低于4 000。

2.2 实验中试液配制

2.2.1 混合对照品溶液制备 精密称取梓醇对照品5.10 mg以及毛蕊花糖苷对照品 10.20 mg，用(1%乙腈)流动相定容至50 mL容量瓶中，均匀混合，得到浓度为 102 mg·L－1以及 204 mg·L－1的对照品混合溶液。

2.2.2 供应品溶液制备 取供试品除去包衣，研细，称量1.0 g，精密称定，加入甲醇100 mL，回流90 min，待溶液冷却后进行精密称重，用甲醇进行补重，过滤，取续滤液10 mL，水浴蒸干。残渣利用流动相即1%乙腈溶解转移至25ml容量瓶中并定容，即可得到供试品溶液。

2.2.3 阴性溶液制备依据药品所给处方比例称取除地黄、熟地黄外的其它药材同样质量，按养血安神片规定的制作工艺及供应品的制备方法来实现阴性溶液的制备。

2.3 系统试验性试验 分别取出适量混合对照品溶液、供试品溶液以及阴性溶液，用0.45 μm的过滤头过滤。按照上小节2.1中所列的色谱条件对三种实验溶液进行进样10 μL，得到图1，理论塔板数符合要求。

图1 HPLC图

2.4 空白实验 分别取供应品溶液、对照品溶液以及阴性溶液按各10 μL参照上述色谱条件进样实现毛蕊花糖苷含量的测定，得到的图谱结果显示阴性溶液无干扰(图1)。

2.5 线性关系的考察 分别取得2.2.1小节制备条件下的混合对照品溶液 10、8、6、4、2、1 μL，按照色谱条件来进行测定，并记录每组情况下得到的色谱图。以进样量(X)对峰面积的积分值(Y)进行线性回归计算，在处理后得到其回归方程。梓醇方程表达为 Y=53 554X －4012，r=0.999 8，线性范围是0.102 ～ 1.020 μg;毛蕊花糖苷的方程表达为 Y=2.03 ×106X －1.78 ×104，r=0.999 6，线性范围是0.204 ～2.04 μg。

2.6 重复性实验 精密称取同一样品(批号:120712)共5份，按含量测定项下的方法制备供试品溶液，按上述色谱条件注入液相色谱仪，计算梓醇和毛蕊花糖苷的平均含量分别为0.214 mg·g－1(RSD=0.86%);0.478 mg·g－1(RSD=0.95%)。表明本测定法重复性良好。

2.7 稳定性实验 精密吸取依法制备的同一供试品溶液，在24 h内每隔2 h重复进样，共12次，每次10 μL，计算峰面积的相对标准编差分别为RSD=1.15%(n=12)、RSD=1.26%(n=12)。结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 精密度实验 取适量供试品溶液，进行6次重复进样实验，最后得出梓醇峰面面积 RSD=0.45%，毛蕊花糖苷峰面面积 RSD=0.56%，实验结果说明该方法有着良好的实验精密度。

2.9 加样回收率实验 取已知含量的供试品(批号120806)，平行6份，分别精密加入毛蕊花糖苷以及梓醇对照品适量，按供试品溶液的制备方法处理。测定各含量，结果见表1和表2。可见用此法测定毛蕊花糖苷和梓醇含量加样回收率良好，方法准确、可靠。

表1 梓醇加样回收率实验(n=6)

表2 毛蕊花糖苷加样回收率实验(n=6)

2.10 样品测定 从养血安神片中选取不同的3批次药品，将适量的药物粉碎后各取1g，经过精密称定后，依据2.2.2项下介绍的溶液制备处理方法进行溶液配制，同时将得到的溶液依据2.1项下的色谱条件的测定，得到的数据含量如表3所示。

表3 养血安神片含量测定(n=3)

3 讨论

3.1 实验中测定波长的选择 查阅有关资料信息得知毛蕊花糖苷和梓醇吸收波长最为明显的位置为210 nm以及337 nm处。且梓醇在337 nm波长处没有明显的吸收表现，同时210 nm处的毛蕊花糖苷也几乎看不出有任何改变。故而在210 nm的波长位置选择进行实验检查。

3.2 选择合适的提取条件［4－6］笔者在进行实验之前曾经对甲醇回流最初3 h提取;对饱和正丁醇进行3 h回流提取;利用超声对水饱和正丁醇进行40 min处理;在进行水溶解后对水饱和正丁醇实行4次萃取等方法从各方面进行了综合比较，对比结果显示用超声对甲醇进行处理最终会有最高含量的提取，之后又进行了不同时间对甲醇的超声处理比较，实验结果证实在40 min的时候对溶液提取可以获得最高含量的效果。

3.3 合理选择色谱方法和梯度条件 试验中参考中国药典2010年版中对于地黄含量的测定方法，在讨论分析之后发现药典中毛蕊花糖苷以及梓醇的含量测定中流动相成分一致，但比例不同，所以考虑用梯度洗脱，笔者综合考查了不同流动相以及不同梯度条件下混合液的色谱情况，曾选择0.5%冰醋酸－甲醇(58∶42)、甲醇－乙腈－1%冰醋酸(15∶10∶75)、0.1%并存算－乙腈梯度洗脱用作流动相，得到的实验结果证实上述配比均不能够达到良好的分离效果。最终在参考大量实验文献后，经过溶液比例调整，得到1%冰醋酸－乙腈(87∶13)作为流动相，此时就会实现溶液良好的分离效果。可以用作实验研究检测。

文中笔者结合高效液相色谱法实现了对养血安神片中梓醇与毛蕊花糖苷的同步含量检测，方法学检验证实有着良好的线性、精密度、重复性、重现性，并且检测方法操作简单方便，能够实现梓醇与毛蕊花糖苷的较好程度分离，因此本法可以选作为养血安神片质量控制方法。

［1］ 国家药典委员会.中国药典(一部)［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:133.

［2］ 张贵财，朱旭江，杜 兴，等.HPLC法测定兰州肉苁蓉中毛蕊花糖苷的含量［J］.中国药事，2010，24(8):802 －803.

［3］ 李才堂，文 萍，郭琦丽.HPLC测定裸花紫珠药材中毛蕊花糖苷的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2012，18(1):84 －85.

［4］ 霍燕娴，邓杏好.HPLC同时测定壮元益生丸中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中国现代药物应用，2009，3(15):14－15.

［5］ 丁立新，王心合，杜永祥.高效液相色谱法测定桂花中毛蕊花苷的含量［J］.中国当代医药，2011，18(21):9 －10.

［6］ 吴 龙.反相高效液相色谱法测定地仲强骨胶囊中毛蕊花糖苷的含量［J］.中南药学，2012，10(6):124 －125.