沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤的影响

张家安 周炳荣 胡燕燕 吴维 尹慧彬 张倩 郭娴菲 骆丹

沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤的影响

张家安 周炳荣 胡燕燕 吴维 尹慧彬 张倩 郭娴菲 骆丹

目的探讨沉默miRNA-23a对UVB照射所致成纤维细胞慢性光损伤的影响。方法将成纤维细胞分为空白对照组、UVB光损伤组、miRNA-23a沉默组、UVB光损伤+miRNA-23a沉默组。SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)化学染色测定老化程度，流式细胞仪检测细胞周期，实时PCR法检测p53、p16、p21 mRNA的表达，免疫印迹法检测p53、p16、p21的蛋白表达量。结果UVB光损伤组与UVB光损伤+miRNA-23a沉默组的SA-β-Gal细胞蓝染阳性率分别为(94.60±2.58)%、(48.18±3.70)%，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。G1期阻滞率分别为(85.06±1.52)%、(57.48±2.01)%，两组间差异有统计学意义(P＜0.05)。UVB光损伤+miRNA-23a沉默组的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达量与UVB光损伤组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论沉默miRNA-23a对UVB诱导成纤维细胞衰老有抑制作用，而miRNA-23a对下游衰老相关信号分子的抑制可能是其机制之一。

紫外线；成纤维细胞；微RNAs；细胞衰老

细胞衰老是一种永久性的增殖抑制状态，中波紫外线照射等多种因素可诱导机体提前进入衰老状态，从而引起多种生物学指标异常[1-2]。微小RNA(miRNA)是一种非编码单链小RNA分子，能够通过与基因3'UTR区碱基不完全或完全配对而导致靶mRNA降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后调控[3-4]。研究显示，miRNA-23a在维持正常细胞组织功能中起着重要的作用[5]。我们前期[6]对中波紫外线(UVB)诱导成纤维细胞提前衰老差异性表达的miRNA进行了基因芯片筛选，发现成纤维细胞在接受剂量为50mJ/cm2的UVB照射24h后miRNA-23a的表达出现显著上调。我们通过沉默miRNA-23a，观察光损伤成纤维细胞的各项生物学指标，以了解其对光损伤进程的影响，并探讨其机制。

材料与方法

一、材料

成纤维细胞取自成年健康男性包皮组织。胰酶购于美国Amresco公司，DMEM培养基购于美国Gibco公司，小牛血清购于杭州四季清生物工程材料有限公司，细胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)购于江苏碧云天生物技术研究所，Trizol核酸提取液购于美国Invitrogen公司，miR-23a antagomir购于广州锐博生物科技有限公司，实时荧光定量PCR试剂盒、p53、p16、p21抗体均购于南京凯基生物科技发展有限公司，UVB照射仪购于上海希格玛高技术有限公司(ss-40，发射波长280～ 320 nm，波峰311 nm)。

二、方法

1.细胞的分离、培养与传代：包皮修剪去除皮下组织，剪成0.5 cm×0.5 cm皮块，聚维酮碘浸泡，生理氯化钠溶液冲洗3次，加入0.5%分散酶，4℃消化18～20 h后分离表、真皮。真皮部分以包皮消化液37℃消化5 min后，加入DMEM培养基，吹打、过滤，过滤后将细胞液离心，弃上清，加入含10%胎牛血清、双抗的高糖DMEM培养基，混匀并转移至培养皿中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，细胞接种于直径10 cm的培养皿中，接种密度为1.0×106个/皿，取10～15代对数生长期细胞进行实验。

2.细胞转染：成纤维细胞接种于直径6 cm的培养皿中，无血清培养基培养，用0.5 ml不含血清培养基稀释 12.5 μl(20 μmol/L)miR-23a antagomir储存液，轻轻混匀，室温孵育5 min，同时用0.5 ml不含血清培养基稀释1 μl LipofectamineTM2000，轻轻混匀并室温孵育5 min，将两者轻轻混匀，室温孵育20 min后，将其加入含有细胞的4 ml培养基的培养皿中，培养6 h后，移去miR-23a antagomir-LipofectamineTM2000混合液，更换为新鲜完全培养基，于72 h后使用qRT-PCR法检测转染效率。

3.UVB照射：实验分为4组。空白对照组为未经处理的成纤维细胞；UVB光损伤组为UVB直接照射；miRNA-23a沉默组为单纯 miRNA-23a antagomir转染；UVB光损伤 +miRNA-23a沉默组为先转染，再予UVB照射。UVB照射方法参考文献[6]，用UVB探测仪标定UVB照射仪的照射度，UVB剂量 =UVB照射度×时间(s)，培养板距灯管距离15 cm，照射总剂量为50 mJ/cm2，分为5 d照射，每天 10 mJ/cm2。

4.细胞化学酶染色法检测SA-β-Gal：末次照射后3 d，收集并检测细胞。使用β半乳糖苷酶染色试剂盒，按照说明书进行操作及相关试剂配制：用PBS清洗各组细胞，加入适量SA-β-Gal染色固定液，用PBS清洗各组细胞3次，加入适量细胞染色工作液，在37℃孵育20 h，在光学显微镜下观察蓝染阳性细胞，随机选取3～5个视野(×400)进行阳性细胞计数，统计阳性细胞百分率。

5.流式细胞仪检测细胞周期：末次UVB照射后3 d，用0.125%的胰蛋白酶消化，离心收集细胞，以75%乙醇固定，PBS清洗3次，去除乙醇。取出4℃保存的含50 mg/L Triton的碘化丙锭，于各试验管中分别加入200 μl碘化丙锭，振荡成单细胞悬液，避光室温静置30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

6.实时荧光定量PCR检测成纤维细胞p53、p16、p21的mRNA表达：细胞培养及分组处理同前，用TRIzol法提取细胞总RNA，取RNA样品用1×TE缓冲液稀释样品100倍。测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。计算RNA的浓度 =A260× 稀释倍数 × 0.04 μg/μl。取灭菌且无核酸酶的0.2 ml PCR管，依次加入实验样品RNA 1 μl，Oligo dT 2 μl，无核酸酶的双蒸水至总体积 10 μl，70℃保温10 min，然后冰浴5 min依次加入下列组分：RNase抑制剂(40 U/μl)，0.5 μl 10 × AMV 反应缓冲液 2 μl dNTP 2 μl，MgCl24 μl，逆转录酶 1 μl，无核酸酶的双蒸水0.5 μl。轻轻混匀后，然后200×g离心20 s；先在42℃保温60 min，然后95℃保温5 min；上述产物进行PCR反应，加入2×实时PCR Master Mix 10 μl，模板 1 μl，引物 MIX 2 μl，DEPC水7 μl，置于实时定量仪中并设置反应参数。95℃、5 min，95 ℃、15、s，60 ℃、20 s，72 ℃、40 s共 40 个循环。RT-PCR产物以Ct值作为分析依据。

7.Western 印迹检测 p53、p16、p21 蛋白表达量：收集各实验组细胞，蛋白提取液分别处理细胞，收集细胞总蛋白，BCA法定量后经聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转膜，5%牛白蛋白PBS溶液常温封闭2 h后，加入抗p53、p16、p21的一抗4℃孵育过夜，再加入二抗辣根过氧化酶标记抗体，用封闭液稀释(1∶5 000)室温下摇荡孵育2 h。最后化学增强发光法显带，加入工作液1 min，直接上机，曝光3 min。用灰度分析软件Image Tool3.00进行条带分析。

8.统计方法：用SPSS13.0软件进行分析，两组间用成组t检验，多组间行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、miR-23a antagomir转染成纤维细胞下调miR-23a的表达

miR-23a antagomir转染成纤维细胞后，用qRT-PCR法检测miR-23a的相对表达量。与空白对照组(1.026 8±0.274 9)相比，miR-23a沉默组(0.000 8±0.000 1)的miR-23a的相对表达量明显降低，差异有统计学意义，P＜0.01。

图1 沉默miR-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤指标β-Gal表达率的影响(倒置显微镜下×40) β半乳糖苷酶染色，蓝绿色细胞代表衰老细胞。1a：空白对照组；1b：UVB光损伤组；1c：miRNA-23a沉默组；1d：UVB光损伤+miRNA-23a沉默组

二、沉默miR-23a对UVB诱导成纤维细胞慢性光损伤指标β-Gal表达率的影响

空白对照组β半乳糖苷酶染色阴性。UVB照射后，大部分细胞染色阳性(胞质染为蓝色)，占(94.6±2.58)%。而UVB+miRNA-23a沉默组细胞蓝染面积明显减少，与UVB光损伤组相比，其SA-β-Gal细胞蓝染阳性率有明显降低(48.18±3.70)%，差异有统计学意义(P＜0.05，n=3)，与 UVB 光损伤组相比，UVB光损伤 +miRNA-23a沉默组阳性细胞少而淡染，见图1。

三、沉默miR-23a对UVB诱导慢性光损伤成纤维细胞的细胞周期的影响

单纯沉默miR-23a对G1期细胞没有影响，与空白对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)；UVB光损伤组G1期细胞增加，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；与UVB光损伤组相比，UVB光损伤+miRNA-23a沉默组G1期细胞阻滞率明显下降(P＜0.05)，见图2。

四、沉默miR-23a对UVB诱导慢性光损伤的成纤维细胞p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达的影响

图2 沉默miR-23a对UVB诱导慢性光损伤成纤维细胞的细胞周期的影响2a：空白对照组；2b：UVB光损伤组；2c：miRNA-23a沉默组；2d：UVB光损伤 +miRNA-23a沉默组

经Western印迹及实时PCR检测显示：与空白对照组相比，单纯沉默mir-23a对成纤维细胞的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达没有影响(均P＞0.05)，UVB 照射后 72 h 可见 p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达量明显增加(均P＜0.05)。与UVB光损伤组比较，UVB光损伤 +miRNA-23a沉默组的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表达量明显降低(均P＜0.05)，见表 1，图 3。

讨 论

miRNA调控着超过三分之一的mRNAs，在基因表达中发挥着重要的作用[7]。为验证miRNA-23a在光损伤进程中的作用，我们通过miRNA-23a antagomir转染调节各组miRNA-23a的相对表达量，检测多种与衰老相关的生物学指标。miRNA-23a antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合，阻止miRNA与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。其中，SA-β-Gal是在衰老过程中特异表达的酶，是最常用的鉴别衰老细胞的生物学标志；复制衰老的细胞生长停止于G1期。p53、p16、p21是衰老相关通路中3个重要的信号分子，p16可通过抑制细胞周期蛋白依赖激酶(cycline dependent kinase，CDK)活性，使pRb蛋白去磷酸化，抑制细胞增殖，使细胞周期停滞于G1期，p21同样可通过抑制CDK的活性，使pRb去磷酸化后与转录因子E2F结合，导致细胞阻滞于G1期，p53的表达上调和活化可直接引起细胞衰老，亦可通过p21/Rb通路引起衰老[8-10]。沉默mir-23a表达后再予UVB照射的成纤维细胞，其SA-β-Gal阳性率、G1期阻滞率、p53、p16、p21的 mRNA 及蛋白表达量较单纯UVB照射，均出现明显降低。这些结果表明沉默mir-23a对信号分子p53、p16、p21的下调作用，可能是抑制慢性光损伤的机制之一。

一些研究表明，miRNA-23a能够促进胃腺癌细胞的生长并降低IL-6R的表达量[11]；在人胚肾细胞中，上调miRNA-23a～27a～24-2簇能够促进依赖或非依赖半胱氨酸的凋亡[12]；然而，在人角质形成细胞中，上调mir-23a却有助于降低UVB照射引起的细胞凋亡，并有助于CPD的清除[13]。miRNA-23a在不同细胞中表现出的不同作用可能是因为在不同细胞中的生理功能不同。在我们前期的miRNA芯片结果中，mir-23a在光损伤模型中表达显著增加。同时在经UVB照射的小鼠上皮中，miRNA-23a也是上调的[6]，而沉默miRNA-23a对光损伤有着保护作用。

在UVB照射诱导的成纤维细胞慢性光损伤过程中，沉默miRNA-23a有着重要的保护作用。除miRNA-23a外，也存在着许多其他miRNAs，它们也对老化的进程发挥着调控作用。随着研究的深入，我们期待更多老化相关的miRNAs及其作用的靶基因和下游调控途径被发现和阐明，不仅使我们对miRNA与老化之间的具体作用机制更加明了，也对老化的治疗和预防提供了新的线索。

表1 UVB辐射后72 h各组p53、p16、p21 mRNA的相对表达量

图3 Western印迹检测p53、p16、p21结果 1：空白对照组；2：UVB组； 3：miRNA-23a沉默组； 4：UVB+miRNA-23a沉默组

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2013-03-04)

(本文编辑：吴晓初)

Effect of miRNA-23a silencing on ultraviolet B-induced chronic photodamage to fibroblasts

Zhang Jiaan，Zhou Bingrong，Hu Yanyan，Wu Wei，Yin Huibin，Zhang Qian，Guo Xianfei，Luo Dan.Department of Dermatology and Venereology，First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing 210029，China

Luo Dan，Email:daniluo2011@gmail.com

ObjectiveTo evaluate the effect of miRNA-23a silencing on ultraviolet B(UVB)-induced chronic photodamage to fibroblasts.MethodsFibroblasts from human foreskin were divided into four groups:blank control group receiving untreated，UVB group receiving UVB irradiation only，miRNA-23a group transfected with a miRNA-23a antagomir，UVB+miRNA-23a group receiving transfection with miRNA-23a antagomir followed by UVB irradiation.UVB irradiation was carried out once a day for five consecutive days at a dose of 10 mJ/cm2.Three days after the last irradiation，SA-β-galactosidase staining was performed to detect senescent cells，flow cytometry to analyze cell cycle，and real-time PCR and Western blot to measure the mRNA and protein expressions of p53，p16 and p21，respectively.ResultsBoth the percentage of β-galactosidase-positive cells and proportion of G1-phase cells were significantly higher in the UVB group than in the UVB+miRNA-23a group((94.60±2.58)%vs.(48.18±3.70)%，(85.06±1.52)%vs.(57.48±2.01)%，bothP＜0.05).Significant differences were observed in the mRNA and protein expressions of p53，p16 and p21 between the UVB group and UVB+miRNA-23a group(allP＜0.05).ConclusionsThe silencing of miRNA-23a may suppress UVB-induced chronic photodamage，which is likely to be associated with the inhibition of senescence-associated downstream signaling molecules.

Ultraviolet rays；Fibroblasts；MicroRNAs；Cell aging

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.006

国家自然科学基金(81000700、81171518)；江苏省自然科学基金(BK2012877)

210029南京医科大学第一附属医院皮肤性病科

骆丹，Email：daniluo2011@gmail.com