人脂肪间充质干细胞体外向黑素细胞分化的研究

闵敏 张雪静 马红 许辉 李遇梅

人脂肪间充质干细胞体外向黑素细胞分化的研究

闵敏 张雪静 马红 许辉 李遇梅

目的建立体外诱导人脂肪间充质干细胞(hADSC)向黑素细胞分化的方法。方法由人皮下脂肪分离培养获得hADSC，流式细胞仪检测细胞表型，成骨成脂分化证明分化潜能。将干细胞生长因子(SCF)、内皮素3(EDN-3)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等加到条件培养基中，促使第5代hADSC向黑素细胞方向诱导，诱导至第10周。未诱导组为正常对照组。使用实时荧光定量PCR检测黑素相关基因小眼畸形转录因子(MITF)，酪氨酸激酶受体c-Kit(KIT)，多巴色素异构酶(DCT)，酪氨酸酶(TYR)，酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)，性别决定区域相关转录因子10(SOX10)mRNA的表达量，统计学分析采用单因素方差分析及LSD-t检验。诱导结束后，通过免疫细胞化学法、细胞免疫荧光法进行鉴定。结果流式细胞仪显示分离培养获得的hADSC 高表达 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166，阳性率均在 95%以上；低表达或不表达 CD31、CD34、CD45，人白细胞DR抗原(HLA-DR)。成骨成脂分化结果显示hADSC具有分化潜能。实时荧光定量PCR结果显示，诱导 10 周后，MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 mRNA 的表达水平分别为 0.325±0.012，0.042±0.006，0.046±0.013，0.036±0.005，0.041±0.003，0.225±0.014，与诱导0周组相比，均有上调(P＜0.05)。诱导结束后，免疫细胞化学MITF、HMB45染色阳性，细胞免疫荧光TYRP1、S100阳性表达。结论由人脂肪间充质干细胞诱导所得细胞具有一定的黑素细胞生物学特性。

人脂肪间充质干细胞；分化；黑素细胞

人表皮黑素细胞在保护人皮肤免受紫外线损伤过程中起关键作用，同时与多种皮肤疾病相关[1]。它的损伤或破坏会导致一系列色素紊乱性疾病，如斑驳病、白癜风。其中，白癜风是常见疾病，全球发病率大约为0.1%～2%，然而其发病机制尚不明确[1]。近年来干细胞移植治疗白癜风的研究日益受到重视。人脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSC)由 zuk 等[2]首次从抽脂手术脂肪中分离获得的一类具有多向分化能力的干细胞，具有易获取、高产率、低免疫原性等优点。研究显示，hADSC在不同诱导条件下，可以分化为脂肪样细胞、软骨样细胞、成骨样细胞、神经样细胞、心肌样细胞、胰岛素分泌样细胞、表皮样细胞等[3-4]。本研究拟建立体外诱导hADSC向黑素细胞分化的方法，为黑素细胞的进一步研究打下基础。

材料与方法

一、试剂和材料

人脂肪组织来源于产科15例剖宫产者腹部皮下脂肪，平均年龄30岁，体质指数22～24，健康状况良好，无系统性疾病。低糖改良Eagle培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司。鼠抗人CD29-异硫氰酸荧光素(FITC)、CD31-FITC、CD34- 藻 红 蛋 白 (PE)、CD45-PE、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC及同型IgG对照购自美国eBiosciences公司。Ⅰ型胶原酶、MCDB201培养基、3-异丁基-1-甲基黄嘌吟(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、干细胞生长因子(SCF)，内皮素-3(EDN-3)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)、霍乱毒素(CT)、4'，6-二脒-苯基吲哚(DAPI)等购自美国Sigma公司。反转录及实时荧光定量PCR全套试剂盒购自日本TaKaRa公司。兔抗人MITF、鼠抗人TYRP1、鼠抗人S100抗体购自美国Santa Cruz公司；鼠抗人HMB45多克隆抗体购于武汉博士德生物工程有限公司。S-P即用型试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒，二抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，FITC标记山羊抗小鼠IgG)购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

二、试验方法

1.hADSC分离和培养：实验步骤在Zuk等[2]的基础上作部分调整。无菌条件下将无菌脂肪组织剪碎至约1 mm3细小颗粒，D-Hanks液漂洗3次。0.15%Ⅰ型胶原酶37℃摇床消化45 min。加入10%FBS低糖DMEM终止消化。200目筛网滤过，1500 r/min(离心半径15 cm)离心10 min(水平离心半径)，PBS洗2遍。用含10%FBS，100 U/ml青霉素，100 mg/L链霉素的低糖DMEM重悬，以2×104/cm2接种至6孔板中。

2.细胞表型流式细胞检测：第5代hADSC胰酶消化后制成单细胞悬液。将细胞分装于1.5 ml EP管中，每管 100 μl，细胞密度为 105/ml，加入荧光标记 抗 人 CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC、IgG2a-FITC、IgG1-PE作为同型阴性对照。4℃避光孵育30 min，流式细胞仪检测。

3.体外诱导hADSC向脂肪细胞分化：取第3代hADSC，待细胞达80%融合后，改用成脂肪诱导培养基，含高糖 DMEM，10%FBS)，1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX，10 μmol/L胰岛素。2周后油红染色鉴定脂滴。

4.体外诱导hADSC向成骨细胞分化：取第3代hADSC，待细胞达80%融合后，改用成骨诱导培养基， 含高糖 DMEM，10%FBS，1 μmol/L 地塞米松，200 μmol/L 抗坏血酸，10 μmol/L β-甘油磷酸钠。4周后行茜素红S染色鉴定钙结节。

5.L-Wnt3a细胞培养上清收集：L-Wnt3a细胞购自美国ATCC公司，使用含10%FBS的HDMEM培养。以1∶10进行传代，接种至75 cm2培养瓶，每瓶含10 ml完全生长培养基，培养4 d细胞基本融合后，收集上清并无菌过滤，做为第一批上清。重新注入10 ml新鲜培养基，继续培养3 d后收集上清并无菌过滤，此为第二批上清。按1∶1混合上述两批上清，即为Wnt-3a条件培养基(L-Wnt3aconditioned medium，L-Wnt3a-CM)。4℃避光保存，其内所含的Wnt3a蛋白，将被作为诱导因子添加到培养基中。

6.黑素细胞培养上清收集：人表皮黑素细胞购于美国ScienCell公司。取第5代人黑素细胞以5×103/ml密度接种于6孔板。待细胞生长稳定后，予低剂量NB-UVB照射(强度0.5 J/cm2，时间30 s)，24 h后收集上清，即为黑素细胞条件培养基。过滤除菌，4℃避光保存。作为hADSC分化为黑素细胞的母液备用。

7.hADSC向黑素细胞诱导分化：取第5代hADSC，以5×104/ml密度接种于24孔板，用含10%FBS的L-DMEM培养至细胞80%融合后，更换为黑素细胞诱导培养基[5-6]，隔天换液，细胞达80%～90%融合时进行传代。至第6周予NB-UVB照射，0.5 J/cm2，每周 1 次，时间 30 s[7]，继续培养至第10周进行相关检测。未诱导组设为正常对照组。

8.实时荧光定量PCR检测诱导各时间组黑素细胞相关基因mRNA的表达：Trizol法提取诱导不同时间组细胞总RNA。紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。cDNA的合成操作严格按反转录试剂盒说明书进行。扩增基因引物序列见表1。扩增条件为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循环 40次。以β肌动蛋白为内参照，结果用2-ΔCt法换算(ΔCt=Ct目的基因-Ct内参基因)。

9.细胞免疫化学法鉴定细胞：4%多聚甲醛室温固定20 min，3%过氧化氢去离子水室温孵育10 min。TritonX-100 通透 20 min。室温封闭 20 min，分别滴加一抗兔抗人MITF、鼠抗人HMB45蛋白单克隆抗体，4℃过夜，PBS洗涤3遍。分别滴加二抗山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG，室温孵育30 min。DAB显色，蒸馏水适时终止，苏木素复染，脱水、透明、封片。

10.细胞免疫荧光法鉴定细胞：4%多聚甲醛室温固定20 min，Triton-100室温通透10 min，室温封闭20 min，分别滴加一抗鼠抗人TYRP1、鼠抗人S100共同室温避光孵育45 min，PBS洗涤3遍，分别滴加FITC标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育15 min，DAPI室温染10 min，荧光显微镜观察，拍照。

表1 扩增基因引物序列

结 果

一、hADSC分离培养结果

原代hADSC接种后，48 h大部分已贴壁，换液去除非贴壁细胞；72 h后可见细胞形态改变，细胞生长有极性，融合后呈旋涡状、河流状。12代以内细胞的形态无明显变化。

二、细胞表面标志检测

CD29 和 CD105，CD44 和 CD166，CD73 和 CD90均双阳性表达，阳性率均在95%以上。造血系统、白细胞、内皮标志物及组织相容性复合物CD31和CD34，CD45和HLA-DR低表达或阴性表达。

三、hADSC诱导分化潜能检测结果

hADSC经成脂诱导2周后，油红O染色见脂滴呈红色(图1a)，正常对照组阴性(图1b)。hADSC经成骨诱导28 d后茜素红S染色见钙结节呈桔红色，即茜素红染色阳性(图1c)，正常对照组阴性(图1d)。

四、实时荧光定量PCR检测结果

诱导不同时间各组间小眼畸形转录因子(MITF)、酪氨酸激酶受体c-kit(KIT)、多巴色素异构酶(DCT)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1(TYRP1)、性别决定区域相关转录因子(SOX10)mRNA的表达行单因素方差分析发现，差异具有统计学意义(F=205.99，220.02，138.31，71.68，114.90，295.85，P＜0.05)。 再用 LSD-t检验发现，与诱 导 0 周 组 比 较 ，MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 mRNA 表达量分别自诱导第 5、7、6、4、5、3周开始增加(均P＜0.05)。

五、免疫细胞化学染色结果

光镜下可见诱导组细胞形态呈双极化及多极化，与黑素细胞典型树突结构相似，抗体MITF及HMB45染色均见到诱导组细胞胞体及树突被染成棕褐色，呈阳性(图2a，2b)。正常对照组hADSC细胞形态为长梭形，与诱导组细胞形态有明显差异，其中抗体MITF染色呈弱阳性，抗体HMB45染色呈阴性(图 2c，2d)。

六、细胞免疫荧光结果

荧光显微镜观察示带有FITC 荧光标记的抗体TYRP1、S100在诱导后细胞胞质中均显示绿色荧光，呈阳性表达，细胞核由DAPI标记，呈蓝色(图3a，3b)，对照组阴性表达。

图1 成脂成骨染色结果(×200) 1a：成脂诱导组，油红O染色见细胞内脂滴呈红色；1b：成脂正常对照组，油红O染色未见脂滴形成；1c：成骨诱导组，茜素红S染色见钙结节呈桔红色；1d：成骨正常对照组，茜素红S染色未见钙结节形成

图2 细胞免疫化学小眼畸形转录因子抗体及人黑素瘤抗体染色结果(×100) 2a：诱导组小眼畸形转录因子抗体表达阳性，胞体和树突呈棕褐色；2b：诱导组人黑素瘤抗体表达阳性，胞体和树突呈棕褐色；2c：正常对照组小眼畸形转录因子抗体表达弱阳性，胞体可见部分棕色颗粒；2d：正常对照组人黑素瘤抗体表达阴性

讨 论

我们对传统方法稍加改进获得hADSC。细胞表型检测发现 hADSC 高表达 CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD166，低表达 CD31、CD34 及 CD45。和骨髓间充质干细胞一样，hADSC低表达Ⅱ类抗原，仅有0.05%表达HLA-DR，与Kicic等[8]的报道一致。有研究报道，同种异体hADSC移植不会引起免疫反应，为hADSC移植奠定了基础[9]。

黑素细胞的发育分化过程复杂，机制至今尚未完全明确。研究显示，在人胚胎干细胞、人毛发滤泡起源的神经嵴干细胞向黑素细胞分化过程中，SCF、bFGF、EDN3是必需的[7]。bFGF是成纤维细胞的一种有丝分裂原，主要作用在来源于中胚层和神经外胚层的组织细胞，它能显著提高黑素细胞的迁移能力和p125FAK在黑素细胞中的表达[10]。EDN3是促使神经嵴细胞向成熟黑素细胞分化的关键因子[11]。

图3 酪氨酸酶相关蛋白1、S100蛋白在诱导后细胞中的表达情况(×200) 3a：酪氨酸酶相关蛋白1在胞质中呈绿色荧光；3b：S100蛋白在胞质中呈绿色荧光

为了建立一个更好的诱导微环境，我们改进了体外诱导方法：对生长稳定的人黑素细胞进行窄谱中波紫外线(NB-UVB)照射，受到照射的细胞会应激产生一些生长因子，分泌于培养液中，我们收集上清液作为母液，在此基础上添加上述诱导因子进行诱导。本次研究中，通过在体外模拟诱导微环境，初步建立由hADSC向黑素细胞分化的体系。诱导分化至第10周，细胞形态已趋近黑素细胞的典型树突形态，着色加深，黑素细胞标志物如MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 均有稳定表达，细胞免疫化学及免疫荧光结果均显示，所诱导细胞表达黑素细胞相关蛋白。

MITF是在色素细胞发育早期出现的一个标志，它是神经嵴细胞定向分化发育成黑素细胞过程中最早发生的标志之一。MITF介导多种信号级联过程，在色素细胞发育、分化和功能调节中起作用。MITF通过激活色素相关基因TYR、DCT来调节黑素细胞发生发展，同时通过上调抗凋亡基因如Bcl-2和BCL-XL来维持黑素细胞存活[12]。通过构建诱导微环境，将hADSC诱导分化为具有一定黑素细胞生物学特性的目的细胞。这为进一步体内实验和色素脱失性疾病的治疗奠定了基础。然而，我们所建立的黑素诱导分化体系包含不同影响因素，其中的必需与非必需影响因子有待进一步论证。同时，本实验诱导周期长，细胞活性的维持以及相关肿瘤指标的监测显得十分必要，由此引出了另一个亟需解决的问题——如何更高效率地体外诱导黑素细胞，值得更加深入的研究。

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2013-01-04)

(本文编辑：尚淑贤)

In vitroinduction of differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells into melanocytes：an experimental study

Min Min*，Zhang Xuejing，Ma Hong，Xu Hui，Li Yumei.*Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，Jiangsu，China

Li Yumei，Email:l.yumei@aliyun.com

ObjectiveTo establish a method for inducing human adipose-derived mesenchymal stem cells(hADSCs)to differentiate into melanocytesin vitro.MethodshADSCs were isolated from human subcutaneous fat tissue，and subjected to phenotypic analysis by flow cytometry.The differentiation potential of the hADSCs was evaluated by induction of osteogenic and adipogenic differentiation.Then，the fifth passage hADSCs were induced to differentiate into melanocytes by conditioned medium containing stem cell factor(SCF)，endothelin 3，basic fibroblast growth factor(bFGF)for ten weeks.Those hADSCs receiving no induction treatment served as the normal control.Subsequently，real-time fluorescence-based quantitative PCR(RT-PCR)was performed to determine the mRNA expressions of melanin-associated genes including microophthalmia-associated transcription factor(MITF)，ckit receptor tyrosine kinase(KIT)，dopachrome tautomerase(DCT)，tyrosinase，tyrosinase-related protein-1(TYRP1)，and sex determining region Y-box 10 (SOX10).Statistical analysis was done by one-factor analysis of variance and the least significant difference(LSD)test.Further more，the hADSC-derived melanocytes were identified by immunocytochemistry and immunofluorescence assay.ResultsAs flow cytometry revealed，the isolated hADSCs showed high expressions of CD29，CD44，CD73，CD90，CD105 and CD166 with the positivity rates being more than 95%，but low or absent expressions of CD31，CD34，CD45 and human leukocyte antigen(HLA)-DR.Additionally，the osteogenic and adipogenic differentiation of hADSCs was successfully induced.The relative mRNA expression levels of MITF，KIT，DCT，tyrosinase，TYRP1 and SOX10 were 0.325±0.012，0.042±0.006，0.046±0.013，0.036±0.005，0.041±0.003，and 0.225±0.014 respectively in hADSCs induced for 10 weeks，which were significantly upregulated compared with the normal control hADSCs(allP＜0.05).Moreover，the induced hADSCs showed positive immunocytochemical staining for MITF and HMB45，as well as positive cytoimmunofluorescence staining for TYRP1 and S100.ConclusionThe hADSCs have been successfully induced to differentiate into cells with the biological characteristics of melanocytes.

Human adipose-derived mesenchymal stem cells；Cell differentiation；Melanocytes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.002

国家自然科学基金(30972663)；中华医学会皮肤性病学分会-安斯泰来皮肤病学研究基金

212000江苏镇江，江苏大学附属医院皮肤科(闵敏、马红、许辉、李遇梅)；镇江市第二人民医院(张雪静)

李遇梅，Email：l.yumei@aliyun.com