白癜风患者黑素细胞移植的疗效与白介素6、可溶性白介素6受体水平的关系

汤慧娟 周妙妮 傅丽芳 洪为松 尉晓冬 郑冬娣 许爱娥

白癜风患者黑素细胞移植的疗效与白介素6、可溶性白介素6受体水平的关系

汤慧娟 周妙妮 傅丽芳 洪为松 尉晓冬 郑冬娣 许爱娥

目的探讨白介素6(IL-6)、可溶性白介素6受体(sIL-6R)与白癜风患者自体培养黑素细胞移植疗效的关系。方法对53例稳定期白癜风患者进行自体培养黑素细胞移植，收集白斑区与非白斑区的疱液，移植后6个月观察疗效，用ELISA的方法测定白癜风患者皮肤组织液中IL-6及sIL-6R水平，比较移植成功组与失败组白斑区及非白斑区组织液中IL-6及sIL-6R水平。结果白癜风患者白斑区IL-6(113.22±81.20)ng/L与非白斑区(84.40±48.78)ng/L，及白斑区sIL-6R(56.28±24.87)ng/L和非白斑区(53.96±25.67)ng/L配对比较，差异有统计学意义。移植失败组与成功组比较：白斑区IL-6(153.61±100.26)ng/L的浓度明显高于移植成功组(88.75±55.75)ng/L(P＜0.05)；非白斑区浓度(100.26±55.17)ng/L与(74.78±42.50)ng/L比较，差异无统计学意义，两组之间sIL-6R的浓度比较，差异均无统计学意义。稳定时间＜1年的白斑区IL-6(148.46±88.00)ng/L与非白斑区(114.82±64.66)ng/L均高于稳定时间≥1年的白斑区(93.54±71.07)ng/L与非白斑区(67.40±25.23)ng/L(P＜0.05)，而sIL-6R比较，差异无统计学意义。节段型白斑区IL-6(77.33±61.70)ng/L明显低于非节段型(131.68±84.54)ng/L(P＜0.05)，非白斑区IL-6及sIL-6R的组间比较，差异均无统计学意义。非节段型患者的移植成功组非白斑区IL-6(78.25±40.30)ng/L、白斑区(96.27±53.390)ng/L与失败组非白斑区(107.02±42.48)ng/L、白斑区(178.90±96.48)ng/L比较，差异均有统计学意义，sIL-6R在两组间比较，差异无统计学意义。结论IL-6在组织液中的异常表达对白癜风患者皮损区的微环境改变有一定的影响，可能与自体黑素细胞移植疗效相关。

白癜风；白细胞介素6受体；白细胞介素6；黑素细胞；移植；治疗结果

白癜风是一种自身免疫性疾病，即由T淋巴细胞发挥特异性免疫效应所致的黑素细胞损伤。在治疗方面，对疗效不佳的稳定期白癜风患者，自体黑素细胞移植是治疗稳定期白癜风的一种方法。洪为松等[1]用自体培养的黑素细胞移植共治疗了632例患者(最大面积达640 cm2)，有效率为82.28%，痊愈率为52.85%，但仍有部分患者移植效果不佳，我们推测可能与白癜风患者皮损区局部微环境异常有关。Wu等[2]在白癜风患者周围皮损CD8+T细胞和黑素细胞共培养的上清液中发现白介素6(IL-6)升高，我们检测IL-6及可溶性IL-6受体(sIL-6R)的水平，探讨是否与移植疗效有关。

资料与方法

一、临床资料

53例稳定期白癜风患者均来自我院皮肤科门诊。其中男24例，女29例，年龄14～58岁，平均28岁，病程0.9～25年，平均9年，其中节段型18例，非节段型35例，诊断与分型均符合文献[3]，根据患者全身皮损无扩大或新发≥6个月为稳定期，6月以内为进展期，53例患者均为稳定期，且病情稳定时间均在6个月以上。移植部位位于面颈部26例、躯干部17例、四肢10例，移植6个月后观察疗效。所有患者均无甲状腺等其他自身免疫性疾病及严重系统性疾病。本研究通过医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

二、方法

1.皮肤组织液标本采集：白癜风患者供皮区选自臀部，常规消毒后，再用BFY-II皮肤分离仪(浙江绍兴卫星机械有限公司)负压吸疱，在需移植的受皮区选一定面积也进行负压吸疱，用虹膜剪沿疱壁边缘剪下疱壁时，在大疱下使用灭菌后的1.5 ml的微量离心管，分别收集供皮区及受皮区沿疱壁流下的液体，以半径5 cm，5 000 r/min离心5min，取上清液，至-80℃保存，移植6个月后检测。

2.自体培养的黑素细胞移植[4]：将虹膜剪剪下的供皮区正常皮肤置于无菌D-Hanks液中，用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA先后在37℃消化10 min。在立体显微镜下刮下角质层下及真皮上的细胞。用D-Hanks液冲洗后以半径5 cm，1 000 r/min，离心5 min，收集沉淀细胞重悬浮于黑素细胞Hul6选择性培养基(F12基础培养基，含bFGF、CT、IBMX和胎牛血清)中，并将细胞团吹打成细胞悬液，调整细胞浓度5×105/ml接种于培养瓶中，置37℃，5%CO2培养箱内培养。在第3天加入基因素(100 μg/m1)以去除角质形成细胞和成纤维细胞的污染，隔天换液1次。当黑素细胞融合后，用0.05%胰酶-EDTA将黑素细胞从培养瓶上消化下来进行传代培养。当细胞数量达到最优接种量[1]时，将黑素细胞从培养瓶上消化下来，离心收集黑素细胞悬浮于F12培养基中备用。用CO2激光磨削掉利多卡因局部麻醉后的受皮区，根据移植白斑区的面积，按600～1 000个细胞/mm2[5]收集黑素细胞，用巴氏吸管将细胞悬液均匀地接种在移植区。无菌凡士林纱布覆盖，外敷含F12培养液湿纱布，包扎固定。嘱咐患者平卧休息1 h，7～10 d后去除纱布，6个月后观察移植效果。

3.皮肤组织液IL-6、sIL-6R的水平的测定：对移植6个月患者白斑区及非白斑区疱液中的IL-6、sIL-6R进行检测。IL-6、sIL-6R的检测试剂盒均购于上海西塘生物技术公司，用双抗体夹心ABCELISA法，按照试剂盒说明书进行操作，予450 nm处测吸光度A值。根据标准曲线和直线回归方程式，计算IL-6、sIL-6R浓度。

4.疗效判断：痊愈为色素恢复 ≥90%，显效为色素恢复50%～89%，好转为色素恢复10%～49%，＜10%为无效，移植成功为痊愈+显效，移植失败为好转+无效。

5.统计分析：SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，患者自身对比用配对t检验，组间比较用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、白癜风患者白斑区和非白斑区皮肤组织液中IL-6、sIL-6R的检测

53例稳定期白癜风患者，白斑区与非白斑区皮肤组织液中IL-6和sIL-6R的表达见表1。

二、IL-6、sIL-6R检测与移植疗效

随访53例自体黑素细胞移植后的稳定期白癜风患者，6月后移植成功33例，失败20例。移植失败组白斑区皮肤组织液中IL-6的浓度比成功组高(P＜0.05)，非白斑区失败组与成功组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。两组之间sIL-6R的浓度差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

三、IL-6、sIL-6R检测与移植稳定时间

53例自体培养黑素细胞移植的白癜风患者稳定时间均≥6个月，其中稳定时间≥1年34例，稳定时间＜1年19例。稳定时间＜1年白斑区IL-6的浓度较稳定时间≥1年的浓度高，差异有统计学意义(P＜0.05)，稳定时间＜1年非白斑区的IL-6浓度显著高于稳定时间 ≥ 1年的浓度(P＜0.05)；两组之间sIL-6R的浓度差异均无统计学意义(P＞ 0.05)，见表 3。

四、IL-6、sIL-6R检测与白癜风分型

35例非节段型及18例节段型患者白斑区IL-6的浓度比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；非白斑区IL-6的水平 为(72.38±57.67)ng/L、(90.58±43.12)ng/L，差异无统计学意义(P＞0.05)。节段型及非节段型白斑区和非白斑区组织液中sIL-6R的水平无统计学意义(P＞ 0.05)，见表4。

五、非节段型白癜风患者IL-6、sIL-6R与移植疗效的关系

35例非节段型患者，随访6个月后，移植成功20例，失败15例，其中白斑区组织液IL-6的浓度在失败组明显高于移植成功组(P＜0.05)，非白斑区的失败组IL-6的浓度与成功组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)；但移植成功组与失败组白斑区及非白斑区组织液中sIL-6R的水平比较，差异无统计学意义(P＞ 0.05)，见表5。

讨 论

白癜风移植手术主要包括自体表皮片移植、自体混悬移植和自体培养黑素细胞移植，其中自体培养黑素移植以供受皮区1∶100[6]的比例获得较多的黑素细胞，更适合较大面积的白癜风治疗。虽然经过个体化培养基进行自体黑素细胞培养移植治疗白癜风有较好的疗效[7]，但仍有部分患者移植失败或效果不佳，可能与稳定期白癜风患者局部白斑皮肤处于免疫异常状态[8]相关。Kirnbauer等[9]认为许多细胞因子如IL-6能导致黑素细胞表面的细胞间黏附分子1(ICAM-1)表达增加，在白癜风的免疫性细胞毒反应中，1CAM-1是中性白细胞与黑素细胞黏附的必需因子，细胞间粘附分子可能抑制黑素细胞的生长[10]，IL-6通过增加效应细胞的迁移及效应细胞和靶细胞间的黏附，诱导黑素细胞免疫性的损伤。

表1 白癜风患者白斑区和非白斑区IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

表1 白癜风患者白斑区和非白斑区IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

注：P值为白斑区与非白斑区比较

组别 例数 IL-6 sIL-6R白斑区 53 113.22±81.20 56.28±24.87非白斑区 53 84.40±48.78 53.96±25.67 t值 3.69 2.113 P值＜0.01＜0.05

表2 白癜风患者移植成功组和失败组IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

表2 白癜风患者移植成功组和失败组IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

注：P值为失败组与成功组比较

组别 例数 IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑失败组 20 153.61±100.26 100.26±55.17 63.24±26.03 59.75±23.40成功组 33 88.75±55.75 74.78±42.50 52.06±23.54 50.44±26.68 t值 2.655 1.771 1.61 1.288 P值＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表3 白癜风患者稳定时间不同的IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

表3 白癜风患者稳定时间不同的IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

注：P值为＜1年与≥1年比较

组别 例数 IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑＜1年 19 148.46±88.00 114.82±64.66 56.84±16.35 54.83±18.80≥1年 34 93.54±71.07 67.40±25.23 55.96±28.79 53.47±29.07 t值 2.475 3.07 0.123 0.183 P值＜0.05＜0.01 ＞0.05 ＞0.05

表4 白癜风患者节段型及非节段型IL-6、sIL-6R的检测(±s)ng/L

表4 白癜风患者节段型及非节段型IL-6、sIL-6R的检测(±s)ng/L

注：P值为节段型与非节段型比较

组别 例数 IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑节段型 18 77.33±61.70 72.38±57.67 56.66±14.94 52.59±17.11非节段型 35 131.68±84.54 90.58±43.12 56.09±28.88 54.66±29.32 t值 2.666 1.295 0.078 0.275 P值＜0.05 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

表5 非节段型白癜风患者失败组与成功组IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

表5 非节段型白癜风患者失败组与成功组IL-6、sIL-6R的检测(±s) ng/L

注：P值为失败组与成功组比较

组别 例数 IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑失败组 15 178.90±96.48 107.02±42.48 63.79±29.96 59.31±26.70成功组 20 96.27±53.39 78.25±40.30 50.31±23.38 51.17±31.36 t值 2.991 2.043 1.384 0.808 P值＜0.01＜0.05 ＞0.05 ＞0.05

本文53例白癜风患者白斑区与非白斑区皮肤组织液IL-6与sIL-6R的自身配对比较，差异均有统计学意义，说明患者皮损的产生可能与皮损区IL-6细胞因子的升高相关，提示IL-6可能参与白癜风的发病机制。这与之前白癜风患者血液[10-11]及皮损中[12]发现IL-6的升高相一致。Wu等[2]从细胞因子的水平对白癜风患者周围皮损CD8+T细胞和黑素细胞共培养的上清液进行研究，发现IL-6的水平是单独黑素细胞培养的3.02倍，是白癜风患者外周血与黑素细胞共培养的17.32倍。

本文结果还显示，移植失败者白斑区组织液中IL-6的浓度显著高于移植成功的患者，且非节段型患者非白斑区IL-6的浓度显著高于白斑区，提示IL-6的异常高表达可能引起局部微环境的改变，破坏黑素细胞，因此，其整体水平可能与移植疗效相关。处于稳定期的白癜风患者接受移植治疗后，洪为松等[13]认为稳定时间＜1年患者的移植疗效不如稳定时间≥1年或者≥5年的患者，说明稳定时间越长，移植疗效越好。我们发现稳定时间＜1年的患者白斑区及非白斑区的IL-6明显高于稳定时间≥1年的患者，提示稳定时间短，移植疗效差，可能与局部的微环境有关。

IL-6是种多效应的细胞因子，IL-6通过增加血管的再生，促进伤口的愈合，手术愈合过程的12 h内，IL-6水平一直升高[14]，我们在12 h内收集疱液离心去上清并冻存于-80℃，所以组织液中IL-6水平的升高也可能是由于促炎症作用引起的自身反应。IL-6R蛋白可以以膜结合和可溶(slL-6R)的两种形式存在，在血液或组织液中与sIL-6R结合形成复合体进行信号转导发挥生物学作用。sIL-6R在移植成功组、失败组、不同稳定时间及不同型别的白斑区及非白斑区之间的比较没有差异，我们推测局部IL-6的升高不是通过与受体结合起作用，或许是刺激IL-17等其他细胞因子改变局部免疫环境，影响白癜风患者自体黑素细胞移植的疗效，但需要更多样本证实。

我们的研究结果说明，IL-6的异常表达，可能引起皮损区微环境的改变，特别是移植失败者IL-6的高表达影响移植疗效，或许可以作为术前筛选移植适应证患者的指标之一，但需要更多样本来证实。在临床上应用IL-6的阻断剂，或许可提高临床移植的疗效，值得进一步研究。

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2013-05-06)

(本文编辑：吴晓初)

Efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation for and its relationship with the levels of interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor in suction blister fluid from patients with vitiligo

Tang Huijuan*，Zhou Miaoni，Fu Lifang，Hong Weisong，Wei Xiaodong，Zheng Dongdi，Xu Aie.*Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University，Hangzhou 310009，China

Xu Aie，Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo investigate the relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation for and the levels of interleukin-6(IL-6)and soluble IL-6 receptor(sIL-6R)in suction blister fluid from patients with vitiligo.MethodsFifty-three patients with stable vitiligo were included in this study，and

autologous cultured melanocyte transplantation.Clinical efficacy was evaluated at six months after the transplantation.Suction blister fluid was collected from vitiliginous and non-vitiliginous skin in these patients before and six months after the transplantation.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the levels of IL-6 and sIL-6R in the blister fluid.Statistical analysis was done using pairedttest and two independent samplest-test.ResultsSignificant differences were observed in the blister fluid levels of IL-6((113.22±81.20)vs.(84.40±48.78)ng/L，P＜0.01)and sIL-6R((56.28±24.87)vs.(53.96±25.67)ng/L，P＜0.05)between vitiliginous and non-vitiliginous skin.The unsuccessfully treated patients showed higher levels of IL-6 in vitiliginous skin((153.61±100.26)vs.(88.75±55.75)ng/L，P＜0.05)but similar levels of IL-6 in non-vitiliginous skin((100.26±55.17)vs.(74.78±42.50)ng/L，P＞0.05)as well as of sIL-6R in both vitiliginous and non-vitiliginous skin compared with the successfully treated patients.The level of IL-6 in the suction blister fluid from both vitiliginous and non-vitiliginous skin was significantly higher in patients with vitiligo stable for less than one year than in those stable for one or more years((148.46±88.00)vs.(93.54±71.07)ng/L，P＜0.05；(114.82±64.66)vs.(67.40±25.23)ng/L，P＜0.01)，but no significant differences were observed for the level of sIL-6R in vitiliginous or non-vitiliginous skin between the two groups of patients(bothP＞0.05).Decreased blister fluid level of IL-6 was observed in vitiliginous skin from patients with segmental vitiligo compared with those with non-segmental vitiligo((77.33±61.70)vs.(131.68±84.54)ng/L，P＜0.05)，but there was no significant difference in the level of IL-6 in non-vitiliginous skin or the level of sIL-6R in vitiliginous and non-vitiliginous skin between the patients with segmental vitiligo and those with non-segmental vitiligo(allP＞0.05).Moreover，significant differences were observed in the level of IL-6 in vitiliginous skin((96.27±53.390)vs.(178.90±96.48)ng/L，P＜0.01)and non-vitiliginous skin((78.25±40.30)vs.(107.02±42.48)ng/L，P＜0.05)，but not in the level of sIL-6R (bothP＞ 0.05)in vitiliginous or non-vitiliginous skin，between the successfully and unsuccessfully treated patients with non-segmental vitiligo.ConclusionsThe abnormal expression of IL-6 may somewhat affect the microenvironment in vitiliginous lesions of patients，which seems to be associated with the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation.

Vitiligo；Interleukin-6 receptors；Interleukin-6；Melanocytes；Transplantation；Treatment outcome

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.008

国家自然科学基金(81071294、81271758)；浙江省自然科学基金重点项目(Z2100973)；省部共建计划项目(WKJ2012-2-036)；杭州市重大科技创新项目(20122513A02)

310009杭州，安徽医科大学附属杭州临床学院(汤慧娟)；杭州市第三人民医院皮肤科(周妙妮、傅丽芳、洪为松、尉晓东、郑冬娣、许爱娥)

许爱娥，Email：xuaiehz@msn.com