尘螨变应原rDer p1诱导HaCaT细胞表达胸腺基质淋巴生成素的研究

倪春雅 高露娟 陈连军 窦侠

尘螨变应原rDer p1诱导HaCaT细胞表达胸腺基质淋巴生成素的研究

倪春雅 高露娟 陈连军 窦侠

目的探讨尘螨变应原rDer p1在体外对角质形成细胞表达胸腺基质淋巴生成素(TSLP)的影响。方法体外培养人角质形成细胞株HaCaT细胞，予以0.1、1和10 mg/L尘螨变应原rDer p1与蛋白酶活化受体2(PAR2)特异性激动剂SLGIKV(500 μmol/L)和拮抗剂VKGILS(500 μmol/L)共培养，以无血清培养基为空白对照。用ELISA法和荧光定量PCR法检测各实验组和对照组TSLP蛋白及mRNA表达水平；通过激光共聚焦显微镜检测细胞内钙流变化分析rDer p1诱导HaCaT细胞产生TSLP和PAR2受体活化的关系。结果1 mg/L和10 mg/L rDer p1组培养12 h上清中TSLP水平分别为(155.5±5.9)ng/L和(228.8±28.7)ng/L，显著高于空白对照组(54.3±13.9 ng/L，P＜0.01)，TSLP表达水平随rDer p1浓度增加而升高。SLGIKV组TSLP表达[(166.2±8.8)ng/L]也显著高于空白对照组(P＜0.01)。10 mg/L rDer p1组和SLGIKV组TSLP mRNA相对表达量在8 h最高，分别为(3.28±0.27)倍和(2.15±0.26)倍，与4 h和24 h相比差异有统计学意义(P＜0.01)。SLGIKV可引起HaCaT细胞钙内流增加；10 mg/L rDer p1也可引起HaCaT细胞钙内流增加，经过PAR2受体特异性阻断剂VKGILS(500 μmol/L)处理后再给予rDer p1刺激，细胞内钙内流峰值明显降低。结论尘螨变应原rDer p1能够通过部分活化HaCaT细胞表面的PAR2受体诱导产生促炎细胞因子TSLP。

皮炎，特应性；屋尘螨；角蛋白细胞；胸腺基质淋巴生成素

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一种慢性炎症性皮肤病。研究已证实大分子蛋白类过敏原能够诱发AD患者皮损复发或加重[1]，其中室内过敏原尘螨是最常检出的过敏原。AD患者进行尘螨变应原斑贴试验可诱发出湿疹样皮损，进一步免疫组化研究提示，尘螨变应原能够通过结合表皮内特异性IgE介导Th2细胞活化，可能是其诱发AD皮炎加重的主要机制之一[2]。近年研究发现，上皮/表皮来源的促炎细胞因子胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP) 在促进Th2细胞分化并启动过敏性炎症反应中具有关键作用[3]。在AD患者皮损中可观察到TSLP表达明显上调，而AD患者非皮损处皮肤则几乎不表达TSLP，提示TSLP和AD患者炎症反应的调节有关[4]。本研究探讨尘螨变应原是否能够通过直接活化角质形成细胞产生T SLP从而诱发皮炎。

材料与方法

一、材料

1.主要材料：人角质形成细胞系HaCaT细胞来自武汉大学中国典型培养物保藏中心，DMEM培养基购于美国Gibco公司，胎牛血清、Trizol、Fluo-4 NW钙检测试剂盒购于美国Invitrogen公司，屋尘螨变应原rDerp1购于美国Abcam公司，蛋白酶激活受体2购于PAR2特异性激动剂SLIGKV和拮抗剂VKGILS购于美国Tcoris公司，TSLP ELISA试剂盒购于美国RD公司，逆转录试剂盒购于日本Takara公司，TSLP Taqman®探针(Hs00263639_m1)和GAPDH Taqman®探针(Hs99999905_m1)购于美国ABI公司。

2.仪器：CO2细胞培养箱购于美国Thermo Scientific公司，超净工作台购于日本Airtech公司，ABI PRISM®7500荧光定量PCR购于美国ABI公司，Leica TCS SP5激光共聚焦显微镜购于德国Leica公司，ELX800酶标仪购于德国Biokit公司。

二、方法

1.细胞培养及处理：HaCaT细胞在37℃、5%CO2条件下用含10%胎牛血清和双抗(青霉素和链霉素)的DMEM培养基培养，以每孔105个细胞接种于无菌有盖24孔板。细胞生长达70%融合时给予无血清DMEM培养基同步化24 h，然后加入相应抗原共培养，以无血清培养基为空白对照。rDer p1共培养终浓度分别为 0.1、1、10 mg/L；PAR2受体激动剂SLIGKV终浓度为500 μmol/L。分别在培养12 h和24 h收集培养上清用于TSLP蛋白水平检测；分别在培养4、8、24 h收集细胞用于提取RNA进行TSLP mRNA表达水平定量。实验重复3次。

2.ELISA法测定培养上清TSLP水平：按照人TSLP ELISA检测试剂盒说明书操作。简述如下：稀释标准品，按复孔加样(浓度梯度的标准品、空白对照和待测上清)、生物素标记二抗和酶标试剂，37℃孵育60 min，重复洗涤5次，拍干后加入显色剂37℃避光显色10 min，加入终止液，酶标仪450 nm波长依序测量各孔的吸光度(A值)。根据标准品的浓度及对应A值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值在回归方程上计算出对应样品的浓度。重复实验至少3次。

3.荧光实时定量PCR测定TSLP表达：Trizol法提取各组细胞总RNA，分光光度仪测定A260/A280比值判断RNA纯度并定量。依据Takara®逆转录试剂盒操作步骤将RNA逆转录为cDNA。用MGBTaqman®探针法在ABI PRISM®7500荧光定量PCR仪上进行实时定量PCR检测，并比较不同时间和不同浓度尘螨变应原刺激组TSLP(TSLP Taqman®探针：Hs00263639_m1；ABI) 表达水平， 以 GAPDH(GAPDH Taqman®探针：Hs99999905_m1；ABI)为内参进行相对定量，PCR反应体系如下：Taqman®Gene Expression Master Mix 12.5 μl， 目 的 基 因Taqman®探针引物 Mix 1.25 μl，cDNA 1.25 μl，H2O补足至 25 μl。反应条件为 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，40个循环。重复实验至少3次。

4.激光共聚焦显微镜检测活细胞钙离子内流：用Fluo-4 NW钙检测试剂盒检测钙内流。培养HaCaT细胞于Lab-Tek®腔室玻片系统，生长融合达50%时，无血清培养基同步化24 h。弃去培养基，用Fluo-4试剂盒中不含Ca2+的缓冲液洗2遍；每孔加入1 ml含Fluo-4的染液，避光，依次37℃孵育30 min，室温孵育30 min。激光扫描共聚焦显微镜下观察，选择488 nm氩激光为激发波长，设定各项参数，记录背景荧光；分别加入用缓冲液新鲜配制终浓度 10 mg/L的 rDer p1、 终浓度 500 μmol/L SLIGKV和空白缓冲液以及500 μmol/L VKGILS预处理30 min后再加入10 mg/L rDer p1，激光扫描共聚焦显微镜下动态扫描细胞内荧光强度变化，每3秒扫描记录1次，连续测量90 s。LAS AF Lite-2.2.1分析软件记录和分析细胞的荧光强度图像及曲线。

结 果

一、rDer p1诱导HaCaT细胞表达TSLP

各浓度尘螨变应原rDer p1与HaCaT细胞共培养12 h，上清液中TSLP表达高于空白对照组，并且随rDer p1浓度增加TSLP水平显著升高(表1)，以rDer p1 10 mg/L组最高(P＜0.01)；SLIGKV刺激组TSLP水平也高于空白对照组(P＜0.01)。延长尘螨变应原rDer p1共培养时间至24 h，TSLP表达与12 h的表达水平差异无统计学意义(表1)。实时定量PCR结果显示，10 mg/L rDer p1和SLIGKV与HaCaT细胞共培养，TSLP mRNA相对表达量都在8 h最高，显著高于4 h和24 h(P＜0.01)，见表2。

表1 HaCaT细胞与屋尘螨变应原rDer p1及蛋白酶激活受体2特异性激动剂SLIGKV共培养上清中胸腺基质淋巴生成素(TSLP)表达水平(±s)

表1 HaCaT细胞与屋尘螨变应原rDer p1及蛋白酶激活受体2特异性激动剂SLIGKV共培养上清中胸腺基质淋巴生成素(TSLP)表达水平(±s)

注：a：各刺激组与空白对照比较t检验，自由度为6

组别 12 h 24 h TSLP(ng/L) t值aP值 TSLP(ng/L) t值aP值空白对照组 54.3±13.9 - - 80.4±28.7 - -SLIGKV组 166.2±8.8 11.23＜0.01 135.2±33.8 2.47＜0.05 0.1 mg/L rDer p1组 59.4±15.4 0.44 ＞0.05 50.6±4.4 2.05 ＞0.05 1 mg/L rDer p1组 155.5±5.9 10.76＜0.01 142.2±26.0 3.19＜0.05 10 mg/L rDer p1组 228.8±28.7 10.31＜0.01 252.2±9.6 11.35＜0.01

表2 HaCaT细胞与屋尘螨变应原rDer p1及蛋白酶激活受体2特异性激动剂SLIGKV共培养不同时间胸腺基质淋巴生成素(TSLP)mRNA相对表达量(±s)

表2 HaCaT细胞与屋尘螨变应原rDer p1及蛋白酶激活受体2特异性激动剂SLIGKV共培养不同时间胸腺基质淋巴生成素(TSLP)mRNA相对表达量(±s)

注：各组不同刺激时间之间的比较采用单因素方差分析，自由度为2

组别 4 h 8 h 24 h F值 P值SLIGKV组 0.69±0.21 2.15±0.26 0.50±0.16 52.30＜0.01 1 mg/L rDer p1组 0.69±0.22 1.15±0.07 0.78±0.39 2.59 ＞0.05 10 mg/L rDer p1组 0.58±0.08 3.28±0.27 1.48±0.44 60.60＜0.01

二、rDer p1部分活化HaCaT细胞表面蛋白酶活化受体2产生钙离子内流

HaCaT细胞与10 mg/L rDer p1共培养，应用钙离子荧光指示剂在激光共聚焦显微镜下观察，可观察到细胞内钙离子升高，出现钙内流增加，达峰时间约为20～25 s；SLIGVK也可引起细胞内钙离子内流，达峰时间约为15～20 s，并且峰值平均吸光度高于Der p1组；HaCaT细胞经过VKGILS处理后再加入尘螨变应原rDer p1共培养，细胞内钙内流峰值明显降低(图1，2)。

讨 论

TSLP是一种IL-7样细胞因子，Friend等[5]首次从小鼠胸腺基质细胞中鉴定。近年来随着人类TSLP及其受体(TSLPR)的成功克隆和测序，对其功能有了较全面的了解。TSLP是一种上皮源性细胞因子，呼吸道上皮细胞和表皮角质形成细胞均可合成TSLP。研究发现，TSLP与呼吸道过敏性炎症的发生密切相关：哮喘患者支气管黏膜上皮、过敏性鼻炎/鼻息肉患者鼻黏膜上皮TSLP表达均显著升高[6-7]。研究发现，在AD患者皮损中TSLP表达也明显上调，而AD患者非皮损处皮肤则几乎不表达TSLP[4]；表皮高表达TSLP的转基因小鼠皮肤呈现AD样皮损表现，皮损中浸润细胞以炎症性Th2细胞为主并伴有外周血IgE显著升高[3]。由此可知，在以Th2细胞为主的过敏性炎症(包括AD、哮喘及过敏性鼻炎)中TSLP均显著升高。

图1 HaCaT细胞经PAR2受体特异性激动剂SLIGKV、屋尘螨变应原rDer p1(10 mg/L)刺激后钙内流一过性升高(以测定细胞内平均荧光吸光度值所示)，经PAR2受体特异性阻断剂VKGILS预处理后rDer p1引起钙内流明显下降

图2 HaCaT细胞经PAR2受体特异性激动剂SLIGKV刺激后细胞内荧光随时间的变化，12 s时细胞内开始出现明显的绿色荧光，并持续至30 s

体外研究进一步证实，TSLP能够促进CD11c+树突细胞及皮肤内朗格汉斯细胞成熟、活化，并合成促使Th2细胞迁移的趋化因子TARC和MDC；同时经TSLP活化的树突细胞及朗格汉斯细胞能够启动CD4+前体T细胞向Th2细胞分化，并产生与过敏性炎症反应相关的细胞因子如白介素4、白介素5和白介素13等[4，8-9]。因此可以说TSLP是一个启动Th2型过敏性炎症反应的重要“开关”。

尘螨变应原rDer p1除了具有免疫原性(诱导机体产生IgE型抗体)外，还具有半胱氨酸蛋白酶活性。研究证实，半胱氨酸蛋白酶可以与PAR2结合产生活化信号，并可进一步动员细胞内Ca2+介导细胞内信号传导[10]。PAR2受体在皮肤多种细胞，特别是角质形成细胞表面表达，参与多种生理和病理过程，如，PAR2在调节表皮通透性屏障、参与皮炎和病理性瘙痒过程中均发挥作用[11]。体外研究发现，尘螨变应原Der p1能够通过PAR2受体活化诱导支气管上皮细胞产生促炎因子白介素6和白介素8[12]，尘螨来源的丝氨酸蛋白酶在体外也可通过PAR2受体活化诱导角质形成细胞产生白介素8[13]。因此我们推测，具有半胱氨酸蛋白酶活性的rDer p1也可通过PAR2受体依赖的途径活化角质形成细胞。本研究以PAR2受体特异性激动剂SLIGKV与HaCaT细胞共培养，结果显示，HaCaT细胞表面PAR2受体活化能够产生TSLP，并显著高于空白对照组。进一步通过激光共聚焦显微镜观察HaCaT细胞钙内流的变化来反映PAR2受体的活化，发现PAR2受体特异性激动剂SLIGKV可引起HaCaT细胞显著的钙内流，rDer p1也可引起HaCaT细胞中等程度的钙内流增加，如果HaCaT细胞给予PAR2受体特异性拮抗剂预处理以封闭受体，rDer p1引起的钙内流降低约50%。这一结果提示，尘螨变应原rDer p1能够部分通过结合并激活角质形成细胞表面PAR2受体产生TSLP。本研究通过体外研究证实，尘螨变应原rDer p1能够部分与HaCaT细胞表面PAR2受体结合，产生活化信号，从而诱导HaCaT细胞产生具有调节Th2分化的促炎因子TSLP。

[1]Hostetler SG，Kaffenberger B，Hostetler T，et al.The role of airborne proteins in atopic dermatitis[J].J Clin Aesthet Dermatol，2010，3(1):22-31.

[2]Holm L，Matuseviciene G，Scheynius A，et al.Atopy patch test with house dust mite allergen--an IgE-mediated reaction？[J].Allergy，2004，59(8):874-882.

[3]Liu YJ.Thymic stromal lymphopoietin:master switch for allergic inflammation[J].J Exp Med，2006，203(2):269-273.

[4]Soumelis V，Reche PA，Kanzler H，et al.Human epithelial cells trigger dendritic cell mediated allergic inflammation by producing TSLP[J].Nat Immunol，2002，3(7):673-680.

[5]Friend SL，Hosier S，Nelson A，et al.A thymic stromal cell line supportsin vitrodevelopment of surface IgM+B cells and produces a novel growth factor affecting B and T lineage cells[J].Exp Hematol，1994，22(3):321-328.

[6]Ying S，O'Connor B，Ratoff J，et al.Thymic stromal lymphopoietin expression is increased in asthmatic airways and correlates with expression of Th2-attracting chemokines and disease severity[J].J Immunol，2005，174(12):8183-8190.

[7]Mou Z，Xia J，Tan Y，et al.Overexpression of thymic stromal lymphopoietin in allergic rhinitis[J].Acta Otolaryngol，2009，129(3):297-301.

[8]Reche PA，Soumelis V，Gorman DM，et al.Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells[J].J Immunol，2001，167(1):336-343.

[9]Ebner S，Nguyen VA，Forstner M，et al.Thymic stromal lymphopoietin converts human epidermal Langerhans cells into antigen-presenting cells that induce proallergic T cells[J].J Allergy Clin Immunol，2007，119(4):982-990.

[10]Rothmeier AS，Ruf W.Protease-activated receptor 2 signaling in inflammation[J].Semin Immunopathol，2012，34(1):133-149.

[11]Lee SE，Jeong SK，Lee SH.Protease and protease-activated receptor-2 signaling in the pathogenesis of atopic dermatitis[J].Yonsei Med J，2010，51(6):808-822.

[12]Asokananthan N，Graham PT，Stewart DJ，et al.House dust mite allergensinduce proinflammatorycytokinesfrom respiratory epithelial cells:the cysteine protease allergen，Der p 1，activates protease-activated receptor(PAR)-2 and inactivates PAR-1[J].J Immunol，2002，169(8):4572-4578.

[13]Kato T，Takai T，Fujimura T，et al.Mite serine protease activates protease-activated receptor-2 and induces cytokine release in human keratinocytes[J].Allergy，2009，64(9):1366-1374.

2013-04-02)

(本文编辑：颜艳)

Effect of the house dust mite allergen rDer p1 on the production of thymic stromal lymphopoietin by human keratinocytes

Ni Chunya，Gao Lujuan，Chen Lianjun，Dou Xia.Department of Dermatology，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200040，China

Dou Xia，Email:douxia@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitroeffect of the house dust mite allergen rDer p1 on the production of thymic stromal lymphopoietin(TSLP)by human keratinocytes.MethodsHuman HaCaT keratinocytes were cultured in the presence of different concentrations(0.1，1 and 10 mg/L)of rDer p1，SLGIKV(a specific agonist of protease-activated receptor-2，500 μmol/L)and VKGILS(a specific antagonist of protease-activated receptor-2，500 μmol/L)alone or in combination for different durations.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and fluorescence-based quantitative PCR were performed to detect the expression levels of TSLP protein in the culture supernatant of and TSLP mRNA in these cells respectively，confocal laser scanning microscopy was used to visualize intracellular calcium influx which reflected the activation of protease-activated receptor-2(PAR2).Those HaCaT cells cultured in serum-free medium served as the blank control group.Statistical analysis was done byttest and one-way analysis of variance.ResultsThe level of TSLP protein was(155.5±5.9)ng/L，(228.8±28.7)ng/L，and(166.2±8.8)ng/L in the culture supernatant of keratinocytes after 12-hour treatment with rDer p1 of 1 mg/L and 10 mg/L as well as SLGIKV respectively，significantly higher than that in the blank control group((54.3±13.9)ng/L，allP＜0.01).The TSLP mRNA expression in keratinocytes peaked at 8 hours after the stimulation with rDer p1 of 10 mg/L and SLGIKV separately，with the relative expression levels being(3.28±0.27)folds and(2.15±0.26)folds，respectively，which were significantly different from those at 4 and 24 hours(allP＜0.01).Both SLGIKV and rDer p1 of 10 mg/L promoted intracellular calcium influx in keratinocytes，while the pretreatment with VKGILS obviously inhibited the rDer p1-induced increase in intracellular calcium influx.ConclusionsThe house dust mite allergen rDer p1 may induce the production of the pro-inflammatory cytokine TSLP by human keratinocytes partly via activating PAR2 receptors.

Dermatitis，atopic；Dermatophagoides pteronyssinus；Keratinocytes；Thymic stromal lymphopoietin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.003

国家自然科学基金(30901289)

200040上海，复旦大学附属华山医院皮肤科

窦侠，Email：douxia@medmail.com.cn