长波紫外线对皮肤成纤维细胞表达和分泌组织蛋白酶G的影响

许庆芳 侯巍 赖维 郑跃 刘晨 陆春

长波紫外线对皮肤成纤维细胞表达和分泌组织蛋白酶G的影响

许庆芳 侯巍 赖维 郑跃 刘晨 陆春

目的研究长波紫外线(UVA)照射对皮肤成纤维细胞组织蛋白酶G(CatG)表达和分泌的影响。方法原代培养的皮肤成纤维细胞来自儿童包皮,10代以内的细胞行后续实验。①以10 J/cm2UVA照射皮肤成纤维细胞,24、48、72 h后提取照射组和对照组细胞蛋白和mRNA,并收集细胞上清液;②分别以10、20、30 J/cm2UVA照射皮肤成纤维细胞,24 h后收集细胞和上清液。用RT-PCR和Western印迹分别检测各组细胞CatG mRNA及蛋白的表达,ELISA检测细胞上清液CatG的含量。结果 10 J/cm2UVA照射后24、48、72 h,照射组细胞CatG mRNA表达分别为0.376±0.014、0.308±0.022和0.296±0.032,对照组分别为0.183±0.003、0.185±0.005、0.182±0.004;照射组细胞CatG蛋白灰度值分别为1.80±0.12、1.41±0.17和1.27±0.09,对照组分别为0.96±0.06、0.95±0.22、1.00±0.14;照射组细胞CatG mRNA、蛋白表达及细胞上清液CatG含量较相应的对照组升高(均P＜0.05),且以照射后24 h表达最高。10、20、30 J/cm2UVA照射后24 h,皮肤成纤维细胞CatG mRNA表达分别为对照组的1.90、2.51、3.04倍,细胞CatG蛋白表达分别为对照组的1.88、3.97、4.72倍,细胞上清液CatG含量分别为对照组的1.36、1.50、1.66倍,均随UVA剂量的升高而增加,其差异有统计学意义(均P＜0.01)。结论急性UVA照射促进皮肤成纤维细胞表达和分泌CatG。

成纤维细胞;组织蛋白酶类;紫外线;细胞衰老

有研究表明,组织蛋白酶G(cathepsin G,CatG)在光损伤皮肤和皮肤成纤维细胞中表达升高,可能通过降解真皮细胞外基质参与光损伤发生[1]。长波紫外线(UVA)可引起皮肤光损伤,但目前还未见UVA照射对皮肤成纤维细胞表达和分泌CatG影响的研究。本研究在体外用不同剂量UVA照射皮肤成纤维细胞,研究成纤维细胞CatG表达和分泌随UVA剂量及照射后时间变化的规律,探讨其在光损伤中的作用及机制。

材料与方法

一、材料

1.皮肤成纤维细胞组织来源:健康人皮肤组织来自于中山大学附属第三医院泌尿外科健康儿童包皮环切术后的包皮组织,所选人群年龄5～9岁,平均6岁。本研究经过中山大学附属第三医院伦理委员会批准(编号:中大附三医伦[2010]2-22号),患者父母知情同意并签署知情同意书。

2.试剂和仪器:DMEM(Dulbeccos modified eagle media)高糖培养基、胰酶、胎牛血清、磷酸盐缓冲液(PBS)、青链霉素为美国Gibco公司产品。一抗兔抗人CatG IgG抗体由美国Abcam公司生产,内参兔抗人GAPDH多克隆IgG抗体、二抗HRP羊抗兔IgG为美国Cell signaling technology公司产品。BCA蛋白定量试剂盒(美国Pierce公司)、ECL显色试剂盒(美国Millpore公司)、预染Marker(加拿大Mbi fermentas公司)、总RNA提取试剂Trizol(美国Invitrogen公司)。Prime-script RT master mix逆转录试剂盒和Sybrpremix ex taqTM试剂盒为日本Takara公司产品。CatG ELISA检测试剂盒为美国Biovision公司产品。UVA紫外线辐射仪(Sigmass-03A,灯管为Philips UVA TL10RS,波长320～400 nm)、UVA照射计(Sigma ss-03,2012年3月6日标定)均为上海希格玛高科技有限公司产品;酶联免疫检测仪(美国Biotek公司);CO2细胞培养箱(美国Thermo scientific公司);Abi prism 7500型实时荧光定量PCR仪。

二、方法

1.原代皮肤成纤维细胞培养:取儿童包皮,参照文献[2]分离培养皮肤成纤维细胞,第3代细胞冻存。细胞复苏后10代以内的细胞行后续实验。

2.UVA照射方法:将3～10代的成纤维细胞按1×106接种于6 cm的细胞培养皿,24 h后从培养箱取出,吸弃培养液,PBS洗2次后,每皿加入2 ml PBS。然后把培养皿置于UVA紫外线辐射仪下,距离紫外线光源约15 cm。用UVA照射检测仪测得的平均照射功率为13 mW/cm2,分别照射769、1 538、2 307 s,使照射1次的UVA剂量分别达10、20、30 J/cm2。对照组细胞加入PBS后置于超净台避光。照射后立即吸弃PBS溶液,加入新鲜培养液,置于95%湿度、5%CO2、37℃培养箱中培养。

3.皮肤成纤维细胞及其培养液在10 J/cm2UVA照射后3 d CatG的变化:实验分UVA照射组和无照射对照组。将成纤维细胞按上述方法予10 J/cm2UVA照射1次。在照射后24、48、72 h提取细胞RNA和蛋白及收集细胞培养上清液。

4.不同UVA剂量对皮肤成纤维细胞及其培养液CatG表达的影响:实验设 10、20、30 J/cm2UVA照射组和无照射对照组。将成纤维细胞按上述方法分别予10、20、30 J/cm2UVA照射1次。在照射后24 h提取细胞RNA和蛋白及收集细胞培养上清液。

5.RT-PCR检测皮肤成纤维细胞中CatG mRNA表达:按照Trizol试剂盒的方法提取各组细胞总RNA。按逆转录试剂盒说明书配制逆转录反应体系,总体积20 μl,然后37℃下反转录15 min,85℃5 s使反转录酶失活,即获得cDNA,置-20℃冰箱中保存。采用染料法(SYBR GreenⅠ)进行相对定量分析。PCR反应体系共20 μl,包括SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ 10 μl,ROXDyeⅡ 0.4 μl, 双蒸水 6 μl,上游和下游引物各 0.8 μl和 cDNA 2 μl。两步法实时定量PCR:95℃5 s,1个循环;95℃5 s,60℃30 s,40个循环。CatG上游引物序列5′-TCCAGAGTCCA GCAGGTCAGAG-3′,下游引物序列 5′-CTGGATGG TCCGCTGATTATATTG-3′,扩增片段长度200 bp。GAPDH上游引物序列5′-GCACCGTCAAGGCTGA GAAC-3′，下游引物序列 5′-TGGTGAAGACGCCAGT GGA-3′,扩增片段长度138 bp。在实时荧光定量PCR仪上读取扩增曲线、熔解曲线和Ct值。重复3次实验,结果取平均值,用2-ΔΔCt法计算目的基因和内参基因的表达相对值。

6.Western印迹检测皮肤成纤维细胞中CatG蛋白表达:提取各组细胞总蛋白-80℃保存。BCA法蛋白定量。总蛋白经10%SDS-PAGE分离后,电转移到PVDF膜上。一抗兔抗人CatG-IgG(1∶500),内参兔抗人GAPDH-IgG(1∶4 000),4℃孵育过夜,TBST液洗膜,加入HRP羊抗兔IgG(1∶1 000)37℃孵育1 h,TBST液洗膜,ECL显色。以目的蛋白条带灰度值与内参条带灰度值的比值作为该目的蛋白相对表达量。

表1 10 J/cm2UVA照射后24 h、48 h、72 h皮肤成纤维细胞及其上清液中CatG表达(±s)

表1 10 J/cm2UVA照射后24 h、48 h、72 h皮肤成纤维细胞及其上清液中CatG表达(±s)

注:n=3

组别 细胞CatG mRNA(2-ΔΔCt) 细胞CatG蛋白(相对表达量) 上清液CatG(ng/L)24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h 24 h 48 h 72 h对照组 0.183±0.003 0.185±0.005 0.182±0.004 0.96±0.06 0.95±0.22 1.00±0.14 122.45±6.46 124.17±6.15 121.72±3.17 UVA组 0.376±0.014 0.308±0.022 0.296±0.032 1.80±0.12 1.41±0.17 1.27±0.09 161.35±7.55 141.76±2.95 139.63±3.04 t值 24.08 9.39 6.18 10.62 2.86 2.85 6.78 4.46 7.06 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

7.ELISA检测皮肤成纤维细胞CatG分泌水平:以无血清培养基培养经UVA照射的细胞及对照细胞,在相应时间点收集细胞上清液,离心后-80℃保存备用。按照ELISA操作程序加样品、标准品、一抗、酶标抗体、底物、终止液,然后在450 nm处测吸光度(A)。绘制标准曲线,根据各样品的A值计算出CatG浓度。

结 果

一、10 J/cm2UVA照射后不同时间皮肤成纤维细胞表达及分泌CatG的变化

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,皮肤成纤维细胞CatG mRNA表达均较相应对照组升高,差异有统计学意义(P＜0.05)。照射后24、48、72 h组CatG mRNA表达水平比较,F=10.18,P＜0.05,差异有统计学意义;LSD检验发现,24 h UVA组CatG mRNA表达均显著高于48 h和72 h UVA组(P＜0.05),但48 h与72 h UVA组间差异无统计学意义(P＞0.05),以24 h UVA组CatG mRNA表达最高。见表1。

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,照射组细胞CatG蛋白表达分别较相应对照组升高1.88、1.48、1.27倍,差异均有统计学意义(P＜0.05)。照射后24、48、72 h组CatG蛋白灰度值比较,F=12.74,P＜0.05);LSD检验发现,24 h与48 h组间(P＜0.05)、24 h与72 h组间(P＜0.05)差异均有统计学意义,但48 h与72 h组间(P＞0.05)差异无统计学意义,以24 h组CatG蛋白表达最高。见表1,图1。

10 J/cm2UVA 照射后 24、48、72 h,照射组成纤维细胞培养上清液中CatG表达均分别较相应对照组升高(P＜0.05)。照射后24、48、72 h组表达水平比较,F=26.51,P＜0.05,差异有统计学意义;LSD分析发现,以照射后24 h组最高。见表1。

图1 10 J/cm2UVA照射后24、48、72 h皮肤成纤维细胞CatG蛋白表达电泳图 1、3、5:分别为24、48、72 h未照光对照组;2、4、6:分别为 24、48、72 h 照射组

二、不同剂量UVA照射后24 h皮肤成纤维细胞表达及分泌CatG的变化

10、20、30 J/cm2UVA 照射后 24 h,皮肤成纤维细胞中CatG mRNA表达分别为无照射对照组的1.90、2.51、3.04倍,均较对照组升高,并随 UVA 剂量增加而升高,经ANOVA及LSD分析,其差异有统计学意义(P＜0.001);CatG蛋白分别较对照组升高1.88、3.97、4.72倍,也随UVA剂量增加而升高,其差异有统计学意义(P＜0.01)。见表2,图2。

表2 UVA呈剂量依赖性地促进皮肤成纤维细胞及其上清液CatG的表达(±s)

表2 UVA呈剂量依赖性地促进皮肤成纤维细胞及其上清液CatG的表达(±s)

注:n=3

组别 细胞CatG mRNA(2-ΔΔCt)上清液CatG(ng/L)对照组 0.259±0.003 0.69±0.07 120.56±4.76 10 J/cm2UVA组 0.492±0.002 1.30±0.02 163.69±5.22 20 J/cm2UVA组 0.651±0.001 2.74±0.04 181.04±5.11 30 J/cm2UVA组 0.788±0.002 3.26±0.08 200.31±7.65 F值 9264.54 436.97 103.30 P值细胞CatG蛋白(相对表达量)＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

图2 不同剂量UVA照射后24 h皮肤成纤维细胞CatG蛋白表达电泳图 1:未照光对照组;2～4:分别为10、20、30 J/cm2UVA照光组

10、20、30 J/cm2UVA 照射组细胞培养上清液CatG含量分别较无照射对照组升高1.36、1.50、1.66倍(均P＜0.001)。不同UVA剂量组之间相比差异也有统计学意义(P＜0.01),细胞培养上清液CatG含量随UVA剂量的增加而升高。见表2。

讨 论

有研究表明,蛋白酶是导致皮肤光损伤多种发病机制的共同环节,在光损伤发病机制中起重要作用[3]。目前蛋白酶研究主要集中于基质金属蛋白酶(MMP)家族[4]。新近一些研究发现,除MMP与皮肤光损伤机制有关外,其他许多酶,如溶酶体组织蛋白酶、中性粒细胞弹性蛋白酶、溶菌酶、中性粒细胞蛋白酶抑制剂(Elafin)及α1抗胰蛋白酶等也参与皮肤光损伤发生[5]。

组织蛋白酶G属于组织蛋白酶家族的丝氨酸亚型,具有分解多种正常真皮连接成分(如Ⅰ型胶原纤维、层黏连蛋白、蛋白聚糖、纤维连接素)的生物功能[6]。CatG可能通过降解真皮细胞外基质参与光损伤[7]。Son等[8]外用CatG抑制剂于无毛雌性大鼠皮肤,结果其可增加UVB诱导大鼠光老化皮肤胶原含量。本研究以10 J/cm2UVA照射体外培养的皮肤成纤维细胞,在照射后24、48、72 h照射组细胞CatG mRNA、蛋白表达和上清液CatG含量均显著高于相应无照射对照组,且以照射后24 h最高,表明UVA从基因和蛋白水平刺激皮肤成纤维细胞CatG表达,并促进细胞分泌CatG,照射后24 h,成纤维细胞表达和分泌的CatG可能开始下降。我们再分别以10、20、30 J/cm2UVA照射细胞,发现UVA呈剂量依赖性地刺激皮肤成纤维细胞表达和分泌CatG。我们的前期研究[1]也发现,光老化皮肤及皮肤成纤维细胞CatG mRNA和蛋白表达均较未老化对照组升高。Cavarra等[9]发现,UVA而非UVB可上调来源于暴光、非暴光部位的皮肤成纤维细胞CatG的活性。因此,UVA不仅能促进皮肤成纤维表达MMP,还刺激其表达、分泌CatG。

UVA通过降低皮肤成纤维细胞表面TβRⅡ表达下调转化生长因子β(TGF-β)/Smad信号通路[10],而其产生的活性氧簇(ROS)激活皮肤成纤维细胞的3条信号通路:磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K-AKT)通路、NF-κB通路及MAPK通路[11]。UVA是否通过这些通路上调皮肤成纤维细胞CatG表达与分泌目前还不清楚。我们的研究已揭示,组织蛋白酶K在UVA照射后3 d体外培养皮肤成纤维细胞中表达升高[2],在光老化皮肤及皮肤成纤维细胞中表达却降低[1],然而CatG在这两者中均升高,表明UVA调控皮肤成纤维细胞组织蛋白酶K、G表达的机制不同。Son等[12]报道,CatG可通过分解真皮基质中的纤维连接素刺激皮肤成纤维细胞MMP的表达,并促进MMP前体转化为活性形式。那么其他的酶是否调控CatG表达或UVA是否通过调控其他酶进而影响CatG表达,均有待研究。

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2014-03-18)

(本文编辑:颜艳)

Effect of ultraviolet A radiation on the expression and secretion of cathepsin G by human dermal fibroblasts

Xu Qingfang*，Hou Wei，Lai Wei，Zheng Yue，Liu Chen，Lu Chun.*Department of Dermatology，Third Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510630，China

Lai Wei，Email:drlaiwei@163.com

ObjectiveTo investigate the effect of ultraviolet A(UVA)radiation on the expression and secretion of cathepsin G(CatG)by human dermal fibroblasts.MethodsDermal fibroblasts were isolated from the foreskins of boys，and subjected to primary culture and subculture.After 10 or less passages，the fibroblasts were collected and divided into several groups to be irradiated with 10 J/cm2UVA followed by 24，48 and 72 hours of additional culture，or be irradiated with 10，20 and 30 J/cm2UVA followed by 24 hours of additional culture，with those receiving no treatment serving as the control group.Subsequently，cells and culture supernatant were collected，real time PCR and Western blot were performed to detect the expressions of CatG mRNA and protein respectively in these cells，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was conducted to measure the expression of CatG protein in the culture supernatant of these cells.ResultsCompared with the control group，the fibroblasts irradiated with 10 J/cm2UVA showed a significant increase at 24，48 and 72 hours in the expressions of CatG mRNA(0.376± 0.014 vs.0.183± 0.003，0.308 ± 0.022 vs.0.185± 0.005，0.296± 0.032 vs.0.182± 0.004，respectively，allP＜0.05)and protein(1.80±0.12 vs.0.96±0.06，1.41±0.17 vs.0.95±0.22，1.27±0.09 vs.1.00±0.14，respectively，allP＜0.05)，as well as in the supernatant level of CatG protein((161.35±7.55)vs.(122.45±6.46)ng/L，(141.76 ± 2.95)vs.(124.17 ± 6.15)ng/L，(139.63 ± 3.04)vs.(121.72 ± 3.17)ng/L，respectively，allP＜0.05)，with the strongest increase observed at 24 hours.At 24 hours after 10，20 and 30 J/cm2of UVA radiation，the expression of CatG mRNA in irradiated fibroblasts was 1.90，2.51 and 3.04 times respectively(allP＜ 0.05)，the expression of CatG protein was 1.88，3.97 and 4.72 times respectively(P＜ 0.05)，and the supernatant level of CatG protein was 1.36，1.50 and 1.66 times respectively(P＜ 0.05)，that in the control group，and there was an increasing trend in all the above three parameters with increasing dose of UVA.ConclusionAcute UVA radiation can promote the expression and secretion of CatG by human dermal fibroblasts.

Fibroblasts;Cathepsins;Ultraviolet rays;Cell aging

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.12.012

国家自然科学基金面上项目(81171523);广东省2012年第一批产业技术研究与开发资金计划项目(2012B031800057);广东省自然科学基金(10151008901000117);2011年CAD-资生堂DQ基金

510630广州,中山大学附属第三医院皮肤科(许庆芳、赖维、郑跃、刘晨、陆春);新疆医科大学第一附属医院皮肤科(侯巍)

赖维,Email:drlaiwei@163.com