丹参地上部分抗动脉粥样硬化活性部位中齐墩果酸和熊果酸的含量测定研究

李 彧 ，曾荣洁 ，欧惠根 ，陈建忠

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州 350122；2.福建省高校中医药学重点实验室，福建 福州 350122）

丹参为唇形科鼠尾草属植物丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）的根及根茎。其性苦，微寒，归心、心包、肝经，是常用的活血化瘀中药［1］。丹参因其独特的药用价值被众多医药生产企业和医疗单位所青睐，药材需用量逐年增加，种植面积也随之增大。我国是世界上最主要的丹参出产国，在提供大量根及根茎时，地上部分均被废弃，且整株植物地上部分干重约为地下部分的 3～5倍，弃之十分可惜［2］。

近年来，丹参同属中其它植物的三萜类化合物以其毒副作用小、疗效明确成为欧美及中亚地区植物化学工作者研究热点之一［3］。越来越多新的活性，特别是心血管活性、抗心律不齐［4］、抗动脉粥样硬化［5－6］以及肿瘤抑制活性［7］被人们所认识。我们前期通过预实验和文献调研，发现丹参地上部分的主要成分除了类似地下根及根茎的酚酸类成分外，另有大量三萜类化合物，主要有熊果酸、齐墩果酸和蔷薇酸等［8］。同时，张琴等研究亦证实丹参地上部分的乙酸乙酯提取部位和一些单体三萜类化合物具有良好的抗动脉粥样硬化活性，有很好的开发利用前景［8－9］。

因此，本实验以齐墩果酸和熊果酸为指标性成分，采用超高效液相质谱联用技术（UPLC-MS），建立丹参地上部分乙酸乙酯活性部位中齐墩果酸和熊果酸的含量测定方法，为丹参地上部分活性部位提取物的质量控制提供方法，而且该结果对丹参地上部分资源综合开发利用具有重要意义。

1 仪器与药品

Waters ACQUITY UPLC-MS／MS超高效液相色谱-质谱联用仪（Waters，Milford，USA）；VDRTEX-5型涡旋混合器（海门市其林贝尔仪器公司）；数显恒温水浴锅HH-4（国华电器有限公司）；旋转蒸发器RE-2000A（上海亚荣生化仪器厂）；DLSB-5／20低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；BSA系列十万分之一分析天平（德国塞多利斯科学仪器有限公司）。

熊果酸和齐墩果酸对照品（纯度≥98%，批号20140102，由上海中药标准化研究中心提供）；甲醇和甲酸（色谱纯，德国默克公司）；95%乙醇、石油醚和乙酸乙酯均为分析纯；水为超纯水。丹参地上部分采自陕西西安，经鉴定为丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的地上部位。

2 方法与结果

2.1 丹参地上部分乙酸乙酯活性部位的制备 根据文献［8］，我们制备了6批次丹参地上部分的乙酸乙酯活性部位。方法如下：取丹参地上部分药材适量，粉碎，置于5 L圆底烧瓶，加8倍量95%乙醇加热回流提取1.5 h，提取3次，过滤并合并滤液，回收乙醇；浓缩液溶解在水中，先用石油醚萃取，取水层，再用乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，减压回收溶剂，水浴干燥，得黑色浸膏，即为乙酸乙酯活性部位提取物，4℃冰箱存储备用。

2.2 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱 （2.1×100 mm，1.7 μm，美国 Waters公司）；流动相：甲醇-0.1%甲酸水（87∶13，v／v），等度洗脱；流速为 0.2 mL／min，柱温为 25℃，进样量为 5 μL。在上述色谱条件下，齐墩果酸和熊果酸的保留时间分别为6.51 min和6.81 min，两者分离度大于1.4，样品中其他成分不影响测定，见图1、图2。

图1 混合对照品的UPLC-MS色谱图

图2 样品的UPLC-MS色谱图

2.3 质谱条件 电喷雾离子源（ESI），毛细管电压：3.20 kV；锥孔电压：50 V；离子源温度：110℃；去溶剂温度：350℃；去溶剂气体流速：600 L／h；锥孔气体流速：50 L／h；检测方式：负离子模式；扫描方式为选择离子反应检测（SIR）模式；用于定量分析的目标离子均为去质子化的准分子离子峰［M-H］-：m／z 455.56（齐墩果酸）和 m／z 455.58（熊果酸）。

2.4 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品1.90 mg和熊果酸对照品2.10 mg，分别置于2 mL容量瓶中，加甲醇制成浓度分别为0.95 mg／mL齐墩果酸对照品母液和1.05 mg／mL熊果酸对照品母液。

2.5 供试品溶液的制备 取“2.1项”中提取物160 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，先用适量甲醇溶解，超声15 min，再用甲醇定容至刻度，微孔滤膜（0.22 μm）滤过，取续滤液即得。

2.6 方法学考察

2.6.1 检测限与定量限 以信噪比为3∶1确定齐墩果酸和熊果酸检测限分别为0.0038和0.0042 ng，以信噪比为10∶1确定齐墩果酸和熊果酸定量限分别为0.0095 ng和0.0105 ng。

2.6.2 线性关系 精密吸取齐墩果酸对照品母液0.5 mL和熊果酸对照品母液0.5 mL，置于同一50 mL容量瓶中，摇匀。精密吸取该溶液0.3 mL转移至EP管中，加入甲醇5.7 mL摇匀，然后依次稀释分别制成齐墩果酸浓度 0.0019、0.00475、0.0095、0.0190、0.0475 和 0.0950 μg／mL 和熊果酸浓度为 0.0021、0.00525、0.0105、0.0210、0.0525 和 0.1050 μg／mL的混合对照品溶液。准确吸取上述混合对照品溶液5 μL，按上述确定的色谱条件进行测定，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，齐墩果酸回归方程为y＝24276x＋78.912，相关系数 r＝0.9913；熊果酸回归方程为 y＝16240x＋111.58，相关系数 r＝0.9937。

2.6.3 精密度试验 日内精密度：准确吸取同一供试品溶液5 μL，连续进样6次，测得齐墩果酸的峰面积RSD为1.0%和熊果酸的峰面积RSD为0.6%。日间精密度：上述供试品溶液连续测定3 d，每天测定6次，测得齐墩果酸的峰面积RSD为3.0%和熊果酸的峰面积RSD为2.5%。

2.6.4 重复性试验 取同一批次乙酸乙酯提取物样品6份，精密称定160 mg，按2.5项下“供试品溶液的制备”方法操作，在上述色谱条件下进行进样测定，测得齐墩果酸的含量RSD为1.3%及熊果酸的含量RSD为0.9%。

2.6.5 稳定性试验 准确吸取同一供试品溶液5 μL，分别在 0 、4、6、8、12 和 24 h 进行测定，以齐墩果酸、熊果酸的峰面积进行考察，进样6次，测得齐墩果酸的峰面积RSD为1.2%及熊果酸的峰面积RSD为1.8%。表明样品至少在24 h内稳定。

2.6.6 加样回收率试验 取已知齐墩果酸和熊果酸含量的乙酸乙酯提取物80 mg，精密称定6份，每份加入相同含量的齐墩果酸、熊果酸对照品，按2.5项下“供试品溶液的制备”方法操作，测定，计算得齐墩果酸平均回收率为100.4%，RSD为2.9%，熊果酸平均回收率为99.4%，RSD为2.5%。见表1和表2。

2.7 样品测定 按照本方法的测定条件，分别测定6批丹参地上部分乙酸乙酯活性部位中齐墩果酸和熊果酸的含量，结果见表3。

3 讨 论

3.1 含量测定指标的选择 现代药理研究表明：齐墩果酸和熊果酸具有杀虫、消炎、防流感、抗糖尿和增强免疫力等功能［8］；同时齐墩果酸也是治疗慢性病毒性肝炎和急性黄疸型肝炎较理想的药物；熊果酸还在抗肿瘤、抗氧化、降脂方面的作用显著［9］。因此研究丹参地上部分中齐墩果酸和熊果酸的含量，对丹参地上部分在功能食品及养生保健领域的应用及推广具有参考价值。

表1 齐墩果酸加样回收率试验结果（n＝6）

表2 熊果酸加样回收率试验结果（n＝6）

表3 丹参地上部分乙酸乙酯活性部位中齐墩果酸和熊果酸的含量测定结果%

3.2 流动相的选择 熊果酸和齐墩果酸都是五环三萜类成分，互为同分异构体，两者极性相似，不易分离，实验前期流动相的摸索阶段，曾选用乙腈-甲酸铵、甲醇-乙腈-甲酸铵、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-甲酸水等不同流动相调整不同比例做对比考察，结果发现以甲醇-0.1%甲酸水（87∶13）为流动相，基线平稳，可得到较为满意的色谱峰形，故最终选用甲醇-0.1%甲酸水（87∶13）作为流动相。

3.3 质谱条件的选择 在本次实验中，碰撞能量、锥孔电压、离子源温度和去溶剂气体温度等质谱参数的设置对于齐墩果酸和熊果酸的检测有重要影响。通过全扫描发现：碰撞能低于40 eV时，齐墩果酸与熊果酸无法产生碎片离子，达到50eV时，也基本上没有明显的碎片离子，说明它们不能形成稳定的子离子，所以多反应检测扫描（MRM）扫描分析方法不适合这两种化合物的定量分析。而选用选择反应检测扫描（SIR），质谱的化学背景降低，目标检测物的信噪比显著提高，可以实现检测的高灵敏度和高选择性。相关文献报道：由于齐墩果酸与熊果酸在化学结构上有羧基，其在负离子检测模式下比在正离子模式下有更好的信号强度和更弱的基线噪音信号。综合考虑，本实验的质谱工作模式为SIR扫描模式和负离子检测模式。

3.4 含量测定结果 本实验测定了6批次的丹参地上部分乙酸乙酯活性部位中齐墩果酸和熊果酸的含量，结果表明提取物中熊果酸的含量达到约0.25%，是齐墩果酸含量的5倍左右。因此，该方法的建立不仅为丹参地上部分活性部位的质量控制提供了方法，而且也表明丹参地上部分具有丰富的熊果酸成分，是一个可利用的药用资源。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：化学工业出版社，2010：70.

［2］蒋海强，于鹏飞，刘玉红.野生丹参地上部分化学成分提取分离与鉴定［J］.山东中医药大学学报，2013，37（2）：166-177.

［3］TOPCU G.Bioactive triterpenoids from Salvia species［J］.J Nat Prod，2006，69（3）：482-487.

［4］SOMOVA L I，SHODE F O，MIPANDO M.Cardiotonic and antidysrhythmic effectsofoleanolic and ursolic acids，methyl maslinate and uvaol［J］.Phytomedicine，2004，11（2-3）：121-129.

［5］OVESNA Z，VACHALKOVA A，HORVATHOVA K，et al.Pentacyclic triterpenoic acids：new chemoprotective compounds ［J］.Neoplasma，2004，51（5）：327-333.

［6］SOMOVA L I，SHODE F O，RAMNANAN P，et al.Antihypertensive，antiatherosclerotic and antioxidant activity of triterpenoids isolated from Olea europaea，subspecies Africana leaves［J］.J Ethnopharmacol，2003，84（2-3）：299-305.

［7］MA C M，CAI S Q，CUI J R，et al.The cytotoxic activity of ursolic acid derivatives［J］.Eur J Med Chem，2005，40（6）：582-589.

［8］ZHANG Q，CHANG Z，YANG J，et al.Antiatherogenic property of triterpenoids-enriched extract from the aerial parts of Salvia miltiorrhiza［J］.Phytotherapy Research，2008，22（8）：1040-1045.

［9］ZHANG Q，CHANG Z，WANG Q.Ursane Triterpenoids inhibit atherosclerosis and xanthoma in LDL receptor knockout mice ［J］.Cardiovasc Drugs Ther，2006，20（5）：349-357.