芪灵扶正清解颗粒对人HepG2肝癌细胞ras基因蛋白表达的影响

章尤权，王清泰，魏建威，王素清，陈旭征，杜 建

（1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州350003；2.福州大学校医院，福建 福州 350002；3.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州350122）

芪灵扶正清解颗粒是福建中医药大学附属第二人民医院的院内制剂（批号：闽药制字Z20120004），主要在消化道肿瘤患者围手术期和围放化疗期使用，在提高肿瘤患者免疫功能、减少放化疗毒副反应、控制瘤体生长等方面疗效显著。前期的研究我们发现芪灵扶正清解颗粒能够诱导丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）亚族 P38磷酸化蛋白的表达从而诱导肝癌HepG2细胞发生凋亡［1］。本研究基于P38MAPK通路的上游关键因子ras，初步研究芪灵扶正清解颗粒对人HepG2肝癌细胞增殖的影响及对ras基因和蛋白表达的影响，为芪灵扶正清解颗粒抗肿瘤作用提供有力的实验证据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 RPMI-1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶（美国 Hyclone Co.）；Trizol试剂（美国 Invitrogen Co.）；SYBR GreenⅠ荧光染料（美国 Applied Biosystems Co.）；反转录试剂盒（大连宝生物工程有限公司）；抗人ras抗体（福州迈新生物技术开发有限公司）；Cycletest Plus DNA试剂盒（美国Becton Dickinson Co.）；7500型荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems Co.）；DM4000B型显微镜（德国 Leica Microsystems Co.）；150 型 CO2培养箱（德国 HERA-cell Co.）；FASCalibur型流式细胞仪（美国 Becton Dickinson Co.）。

1.2 细胞、药材与实验动物 人肝癌细胞株HepG2由福建省肿瘤医院提供，培养在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中；芪灵扶正清解颗粒由福建中医药大学附属第二人民医院制剂室提供；体重（200±20）g的雄性SD大鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：SCXK（沪）2009-0005。所有动物被饲养在温度和湿度相对恒定的环境下，实验通过福建中医药大学动物伦理委员会认可。

1.3 实验方法

1.3.1 含药血清的制备 按照随机数字表法则将大鼠随机分为4组：高剂量组、中剂量组、低剂量组和空白组，每组7只。根据大鼠与人体间等效剂量的换算原则，分别灌胃相当于成人临床每日推荐剂量的 12 倍、6 倍和 3 倍的中药颗粒， 即 5.4 g／（kg·d）、2.7 g／（kg·d）、1.35 g／（kg·d）剂量的中药颗粒及等体积生理盐水，连续灌服7 d，1 d 2次。末次灌胃1 h后腹主动脉取血，分离血清，0.22 μm抽滤除菌，56℃灭活，得到各组含药血清和空白血清。用RPMI-1640培养基1∶5稀释得到20%的含药血清和空白血清，作为干预细胞的剂量。

1.3.2 细胞周期检测 HepG2细胞以1×105个／mL的密度接种在6孔板中，20%含药血清和20%空白血清干预24 h后消化细胞，制备成细胞悬液。细胞周期检测步骤严格按照Cycletest Plus DNA试剂盒的说明书操作，流式细胞仪检测。CellQuest软件获取10000个细胞，ModFit软件分析细胞各个期的百分含量，并计算增殖指数（proliferating index，PI）：

PI＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）×100%。

1.3.3 相对荧光定量PCR检测k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平 20%空白血清和中剂量含药血清作用细胞24 h后，收集细胞提取总RNA并逆转录成cDNA。k-ras、h-ras和 n-ras引物序列见表 1。20 μL PCR反应体系中分别加入SYBR GreenⅠMix，cDNA，上下游引物和 H2O。PCR扩增反应条件为：50℃2 min，95℃预变性 10 min，95℃变性 15 s，60℃退火及延伸1 min，扩增40个循环，60℃延伸时采集荧光信号，熔解曲线考查引物特异性。Ras mRNA的基因表达量（RQ）用 2-△△Ct表示，其中 Ct表示扩增基因荧光强度达到一定阈值的循环数，参照文献［2］。

用超纯水代替cDNA模板进行扩增作为实验的阴性对照。

表1 k-ras、h-ras、n-ras和 GAPDH引物序列

1.3.4 免疫细胞化学染色分析ras蛋白的表达 细胞爬片，置于冷丙酮固定20 min，10%羊血清封闭15 min，加入ras抗体，4℃过夜孵育，洗涤，加入二抗孵育2 h，DAB显色，中性树胶封片，显微镜下观察。阳性细胞呈现棕黄色，表达部位在细胞浆上。用PBS代替ras抗体作为阴性对照。

1.4 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件进行统计，实验数据用±s表示，细胞周期结果采用单因素方差分析，ras基因结果采用Kruskal-Wallis非参数检验。

2 结 果

2.1 芪灵扶正清解颗粒对HepG2细胞增殖能力的影响，见图1和表2。芪灵扶正清解颗粒含药血清干预人HepG2细胞后，G0／G1期细胞的百分含量较空白组明显升高，S期细胞的百分含量较空白组明显减少，PI指数也明显降低，并呈现剂量依赖性。可见芪灵扶正清解颗粒能将肝癌细胞阻滞在G0／G1期，抑制DNA合成。

图1 4组肝癌细胞株HepG2细胞周期典型图

表2 4组间肝癌细胞株HepG2各个时期百分含量比较（±s）%

表2 4组间肝癌细胞株HepG2各个时期百分含量比较（±s）%

注：与空白组比较，1） P＜0.05，2） P＜0.01；与低剂量组比较，3） P＜0.05，4） P＜0.01；与中剂量组比较，5） P＜0.05，6） P＜0.01。

PI 39.20±1.4335.68±0.931）34.07±0.602）32.33±0.532）3）组 别空白组低剂量组中剂量组高剂量组G0／G160.74±1.3764.33±0.931）65.93±0.602）67.67±0.532）3）S 24.50±1.1323.97±0.4421.56±0.311）16.68±0.622）4）6）G2／M 14.69±0.4611.71±0.8612.51±0.4415.65±0.294）5）

2.2 芪灵扶正清解颗粒对ras基因家族成员k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平的影响 见图2。芪灵扶正清解颗粒干预HepG2细胞24 h后，h-ras、k-ras和n-ras mRNA水平平均下降了 81.1%、43.3%和70.7%，统计结果有显著性差异（P＜0.01）。可见芪灵扶正清解颗粒能显著下调 k-ras、h-ras和 n-ras mRNA的表达。

图2 空白组与中剂量组k-ras、h-ras和n-ras mRNA水平比较

2.3 芪灵扶正清解颗粒对P21ras蛋白表达的影响，见图3。P21ras表达阳性的细胞呈现棕黄色，表达部位在细胞浆上。经中剂量含药血清干预后可见P21ras阳性表达的细胞明显减少，可见芪灵扶正清解颗粒能显著下调P21ras蛋白的表达。

图3 空白组与中剂量组P21ras蛋白水平比较

3 讨 论

据统计肝癌在我国恶性肿瘤死因中位列第二［3］。肝癌的临床治疗手段有限，结合中医药治疗成为临床肝癌防治的重要手段之一。芪灵扶正清解颗粒主要由黄芪、女贞子、灵芝、山药、白花蛇舌草和夏枯草组成。现代药理学研究表明：这六味药中含有多糖类、皂苷类、黄酮类、三萜类、蒽醌类、甾体类等多种成分，不仅能够提高围手术期和围放化疗期肿瘤患者的体液免疫和细胞免疫功能，还可诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖和血管新生［4-9］，是值得研究和开发的抗癌辅助用药。

众所周知，细胞周期的启动、运行和终止的异常均可引起细胞失控性生长，从而导致肿瘤的发生。因此阻滞细胞周期的进程可有效抑制肿瘤细胞的增殖，诱导其凋亡。本文应用流式细胞术首先调查了芪灵扶正清解颗粒含药血清对人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响。研究发现芪灵扶正清解颗粒含药血清干预人HepG2细胞后，G0／G1期细胞的百分含量明显升高，S期细胞的百分含量明显减少，且呈现剂量依赖性，说明芪灵扶正清解颗粒含药血清能将人肝癌细胞株HepG2阻滞在G0／G1期，阻止损伤细胞进入S期进行DNA的合成，影响了G1／S转换的进程，有效地抑制了HepG2的过度增殖。

为进一步探讨芪灵扶正清解颗粒阻滞细胞周期的机制，我们调查了与G1／S转换进程密切相关的ras基因和蛋白的表达。ras癌基因是人类肿瘤中最常见的癌基因，有三个家族成员，分别是h-ras、k-ras和n-ras［10］。当这些基因异常表达或突变时，可引起其编码的ras蛋白的异常活化。ras蛋白是一种膜结合型的GTP／GDP结合蛋白，定位于细胞膜内侧，因其分子量为21千道尔顿，故又叫P21ras蛋白。研究发现在原发性肝癌的发生中，位于细胞膜内侧的ras癌基因处于高度激活状态，进而活化ras蛋白。持续活化的ras蛋白激活其下游的效应蛋白raf-1，使得MAPK的激酶MEK磷酸化而活化，进而磷酸化细胞外信号调节的蛋白激酶ERK、C-Jun N端激酶JUK／应激激活蛋白激酶SAPK和p38MAPK，激活下游底物 AP-1、ELK-1、SAP、C-Jun、C-fos和 c-myc， 参与细胞生长、发育、增殖、分化等多种生理过程，并在肿瘤恶变中起重要作用［11］。已证实ras基因和P21ras蛋白的异常表达均可导致原发性肝癌的发生和发展［12］。而ras抑制剂能够诱导肝癌细胞的凋亡，降低ERK磷酸化水平，说明ras可作为原发性肝癌治疗的潜在靶点［13］。有研究表明：ras参与了Cdk2和Cdk4的活化，进而调控Cdk2-cyclin-E2F信号转导通路，从而影响细胞周期G1／S转换的进程［14］。本研究发现：芪灵扶正清解颗粒显著下调HepG2细胞k-ras、h-ras和n-ras mRNA和P21ras蛋白的表达水平。由此我们猜想，芪灵扶正清解颗粒抑制HepG2增殖可能的作用机制与其可以显著抑制肝癌细胞ras基因和蛋白的表达，进而抑制Cdk2-cyclin-E2F信号转导通路，影响G1／S转换的进程有关。

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