二烯丙基二硫活化NADPH氧化酶诱导人白血病K562细胞凋亡

易 岚，伍尤华，谭 晖，何 洁，李林蔚，单 健，苏 琦

(南华大学1.肿瘤研究所、2.药学与生物科学学院、3.附属第一医院肿瘤科，湖南 衡阳 421001)

诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的新方法之一［1］。研究表明［2］，众多的细胞因子和药物具有诱导肿瘤细胞凋亡的能力。其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗癌作用正日益受到关注。研究显示，二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)，大蒜主要有效成分之一，可诱导胃癌、肺癌、结肠癌等多种肿瘤细胞凋亡［3］。我们前期工作已经证实，DADS不仅可诱导人结肠癌等细胞分化与凋亡，而且可诱导人白血病细胞分化与凋亡［4］。DADS对人白血病细胞具有双效作用，小剂量DADS(＜1.25 mg·L－1)诱导人白血病细胞分化，其机制与抑制JAK1/STAT3的酪氨酸激酶活性、下调STAT3与Myc核内表达水平，提高组蛋白乙酰化水平及p21WAF1表达上调有关［5］。而中等剂量 DADS(＞1.25 mg·L－1)可诱导人白血病细胞凋亡，其机制与G2/M期阻滞，活性氧，抑制 ERK 和激活 p38，下调 Bag-1、Bcl-2，上调Fas-L、Bax 等有关［6－7］。但具体机制尚不清楚。

在前期工作的基础上，我们应用蛋白质组学技术筛选出7个与DADS诱导人白血病细胞凋亡的相关的差异蛋白，其中Ras-related C3 botulinum toxin substrate 2(Rac2)表达明显上调［8］，Rac2 是 NADPH氧化酶的6个亚基之一，是NADPH氧化酶活化必不可少的。NADPH氧化酶的激活受高度调控，在此过程中，Rac2与 p67phox相互作用起着关键作用［9］。NADPH氧化酶是诱导产生ROS的主要来源之一，而ROS可触发多种信号转导途径，引起细胞凋亡。本研究在前期工作的基础上，研究DADS活化NADPH氧化酶，通过活性氧途径诱导人白血病K562细胞凋亡，进一步阐明白血病的发病机制，为白血病的诱导凋亡治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 药品及试剂 DADS为Fluka公司产品，小牛血清是杭州四季青生物工程公司产品。BCA蛋白定量试剂盒为Pierce公司产品。RNA抽提试剂盒Ⅱ为Omega公司产品，TRIzol试剂为Invitrogen Life Technologies产品。免疫共沉淀试剂盒为Santa Cruz公司产品。2'，7'-二氯氢化荧光素二脂(DCFHDA)、phorbol myristate acetate(PMA)、diphenyleneiodonium(DPI)、Rac2、p67phox等试剂为 Santa Cruz公司产品。二抗为Abcam Biotechnology公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞培养采用常规培养，培养液为含10%小牛血清的RPMI 1640，在37℃，饱和湿度，5%CO2孵箱中培养，每3～4 d换液传代。取对数生长期细胞用于实验，DADS用培养基稀释到所需浓度。

1.2.2 MTT检测 用含10%胎小牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～104个细胞接种到96孔板，每孔体积100 μl，设3个复孔。加入处理因素并设0对照、空白对照、溶酶对照和不同浓度DADS处理组。在37℃，饱和湿度，5%CO2孵箱中常规培养，继续培养72 h。于结束前4 h除对照组外，每孔加 MTT溶液(5 g·L－1用 PBS配制，pH=7.4)20 μl，继续孵育 4 h，终止培养。离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，充分融解结晶物。酶联免疫检测仪上测各孔吸光度，检测波长570 nm，按下列公式计算抑制率(IR%)。

1.2.3 Real-time PCR引物合成 利用 Primer Premier 5.0软件进行引物设计，送交宝生物工程大连有限公司合成。实时定量PCR使用的管家基金(β-actin)以及NADPH氧化酶的6个亚基引物分别为如下所示。β-actin正义引物序列为5'-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3'，反义引物序列为:5'-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3'，产物长度为211bp;NCF2正义引物序列为:5'-GAAGAAGGGCAATGATAACTGG-3'，反义引物序列为:5'-TAGGAGGAGCTGGGATGTCG-3'，产物长度为155bp;RAC2正义引物序列为:5'-TCATCTGCTTCTCCCTCGT-3'，反义引物序列为:5'-GATGGTGTCCTTGTCGTCC-3'，产物长度为143bp;CYBB正义引物序列为:5'-CAAGATGCGTGGAAACTACCT-3'，反义引物序列为:5'-TGACTTGAGAATGGATGCGAA-3'，产物长度为138bp;CYBA正义引物序列为:5'-ATTGTGGCGGGCGTGTTT-3'，反义引物序列为:5'-CACGGCGGTCATGTACTTCTGT-3'，产物长度为 102bp;NCF1正义序列为:5'-ACCCTGAGCCCAACTATGC-3'，反义序列为:5'-GGACGGGAAGTAGCCTGTG-3'，产物长度为170bp;NCF4正义引物序列为:5'-CAGCCTGATGCCTCCTTACTC-3'，反义引物序列为:5'-TCTGGAACTCCCGCCTTGT-3'，产物长度为120bp。按照Total RNA KitⅡ说明书提取细胞总RNA，用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度。cDNA合成:将2 μg的总RNA 72℃ 10 min预变性，冰上冷却3 min后，按RT试剂盒说明书依次加入各试剂，建立一个总反应体积20 μl的体系，42℃90 min，冰上冷却2 min，－20℃保存备用。Realtime PCR扩增:将标准曲线样品和待测样品分别加入到Real-time PCR反应液中，进行Real-time PCR扩增和检测。几个梯度稀释的DNA模板以及所有cDNA样品分别配置总体积为25 μl反应体系，置于Real-time PCR仪上进行PCR反应。每个样品的目的基因浓度除以其管家基因的浓度，即为此样品此基因的校正后的相对含量。

1.2.4 细胞内活性氧检测 收集细胞，用Hanks液洗涤细胞 2 次，加入终浓度为 10 μmol·L－1的DCFH-DA 400 μl，充分混匀，在37℃条件下避光反应50 min，用Hanks液洗涤细胞3次以去除细胞外荧光剂，用500 μl Hank's液重悬细胞，37℃条件下水浴10 min，流式细胞仪分析荧光强度，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1.2.5 Western blot检测 细胞裂解:分别收集各组细胞，冰PBS洗两次，每1×107个细胞浓度加入100 ～150 μl裂解液(100 mmol·L－1NaCl，10 mmol·L－1Tris-HCl pH 7.6，1 mmol·L－1EDTA pH 8.0，1 mg·L－1Aprotinin，100 mg·L－1PMSF)，冰上裂解1 h，4℃，12 000 r·min－1离心 10 min，上清液即为细胞总蛋白。根据Bradford法进行蛋白含量的测定。蛋白变性后经10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移至PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白的TBST(Tris-HCL 20 mmol·L－1，NaCl 137 mmol·L－1含0.1%Tween-20)封闭1 h，用特异性一抗4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次5 min，相应的二抗孵育1 h，TBST洗3次，每次5 min，化学发光剂检测蛋白质印迹，薄层扫描仪测定印迹区带的光密度值。

1.2.6 免疫共沉淀 按照Seize Classic Mammalian Immunoprecipitation试剂盒说明书进行，将得到抗体复合物进行SDS-PAGE电泳，再进行Western blot检测。

1.3 统计学处理 采用SPSS 12.0统计分析软件，Student't-test法进行差异显著性检验，数值用±s表示，用Sigma Plot10.0软件进行绘图。

2 结果

2.1 MTT检测DADS对K562细胞的增殖抑制作用 如 Tab 1 所示，2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 mg·L－1DADS处理人白血病K562细胞，抑制率分别为32.48%、59.34%、66.42%、81.05%、87.09%，抑制率呈浓度依赖性增加(P＜0.05)。Tween80对照组对细胞增殖无明显抑制作用(P＞0.05)。这些结果表明，DADS以剂量依赖性抑制K562细胞的生长。IC50值在 5.0 mg·L－1左右。

Tab 1 OD570value of different concentrations of DADS treated K562 cells for 48 hours

2.2 DADS诱导K562细胞凋亡过程中 NADPH氧化酶各亚基mRNA表达水平 Real-time PCR结果如Fig 1所示，6 mg·L－1DADS作用K562细胞6 h后，NADPH氧化酶复合物的6个亚基(包括CYBA、CYBB、NCF1、NCF2、NCF4 和 RAC2)相对定量的值分别为1.31×10－3±1.1×10－4、9.85 ×10－4±2.3 ×10－5、1.01 ×10－3±1.1 ×10－4、3.94 ×10－5±3.3 ×10－6、1.65 ×10－3±2.1 ×10－4、1.48 ×10－3±1.8×10－4，较处理前的 1.08 ×10－3±1.3×10－4、4.03×10－4±1.1×10－5、2.57 ×10－4±2.0 ×10－5、1.67×10－5±2.5 ×10－6、1.22 ×10－3±1.2 ×10－4、1.04×10－3±1.4 ×10－4，NADPH 氧化酶各亚基mRNA水平都明显上调(P＜0.05)。

Fig 1 Real-time PCR analysis of mRNA levels of components of the NADPH oxidase in K562 cells treatedby 6 mg·L －1DADS for 6 hours

2.3 Rac2在DADS诱导K562细胞凋亡过程中表达上调 Rac2对NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的6个亚基之一，Rac2是NADPH氧化酶活化是必不可少的。Western blot分析结果如Fig 2所示，与对照组相比，5.0、10.0 mg·L－1DADS 作用 K562 细胞24 h后，蛋白 Rac2的表达水平明显上调(P＜0.05)。

Fig 2 Western blot analysis of expression of Rac2 in K562 cellsinduced by different concentrations of DADS

2.4 免疫共沉淀检测NADPH氧化酶亚基Rac2与p67phox结合 免疫共沉淀结果如Fig 3所示，通过用Anti-Rac2沉淀K562细胞的裂解蛋白，Western blot检测到 p67phox存在。实验结果表明在DADS诱导的 K562细胞凋亡过程中，有 Rac2和p67phox的结合，即存在NADPH氧化酶的活化。

Fig 3 Western blot analysis p67phox in K562 cells after subsided by Anti-Rac2

2.5 NADPH氧化酶激活剂和抑制剂对DADS诱导K562细胞凋亡的影响 我们采用NADPH氧化酶的激活剂PMA和NADPH氧化酶的黄素蛋白抑制剂DPI来进一步研究NADPH氧化酶对DADS诱导K562细胞凋亡的影响。

流式细胞术检测凋亡细胞百分率结果如Fig 4所示，PMA单独作用K562细胞24 h，其凋亡细胞百分率为(10.2±1.04)%，PMA与6 mg·L－1DADS联合处理K562细胞24 h，凋亡细胞百分率为(40.5±2.03)%，与 DADS单独处理组(30.9% ±1.34)%相比，PMA能明显提高DADS诱导K562细胞凋亡的作用 (P＜0.05)，DPI单独作用K562细胞24 h，凋亡细胞百分率为(3.35±0.76)%，可见，DPI并未能诱导K562细胞凋亡。DPI与6 mg·L－1DADS联合处理K562细胞24 h，凋亡细胞百分率为(17.3±1.03)%，实验结果表明DPI能抑制DADS诱导K562细胞凋亡(P＜0.05)。

2.6 NADPH氧化酶的活化是DADS诱导K562细胞活性氧主要来源 流式细胞术检测DCF的荧光强度结果如Fig 5所示，对照组、6 mg·L－1DADS处理K562细胞8 h组、PMA单独处理组、DADS和PMA联合处理组、DPI单独处理组、DADS和DPI联合处理组，流式细胞术检测DCF的荧光强度分别为10.2±0.98、33.0±1.65、30.5±1.73、43.7±1.76、10.0±0.98、11.8 ±0.95，可见，PMA 能提高DADS诱导K562细胞活性氧的水平(P＜0.05)，而DPI明显抑制了DADS作用的K562细胞活性氧的产生(P＜0.05)。

3 讨论

诱导肿瘤细胞凋亡已经成为治疗肿瘤的一种新的可能性［10］。众多的细胞因子和药物都能诱导肿瘤细胞凋亡，其中，大蒜及其烯丙基硫化物的抗肿瘤作用已日益引起人们的关注。DADS作为大蒜提取物中最有效的成分，可以诱导多种肿瘤细胞包括人慢性髓细胞性白血病K562细胞系凋亡，但是其具体机制还有待于进一步研究。我们前期工作已经表明，低剂量(＜1.25 mg·L－1)的DADS具有抗增殖作用，能诱导K562细胞分化［11］。本研究用中等浓度(2.5～20 mg·L－1)DADS来诱导K562细胞凋亡。在我们前期工作的基础上，本研究进一步证实了DADS对K562细胞的生长抑制作用。MTT实验结果表明，DADS以剂量依赖方式抑制K562细胞的活性。

本研究 Real-time PCR结果显示，6 mg·L－1DADS作用K562细胞6h后，NADPH氧化酶复合物的6 个亚基(包括 CYBA、CYBB、NCF1、NCF2、NCF4和RAC2)的mRNA水平都明显上调(P＜0.05)。Rac2是NADPH氧化酶(NADPH oxidase)的6个亚基之一，Rac2的活化是NADPH氧化酶活化是必不可少的。Western blot分析结果表明，与对照组相比，5.0、10.0 mg·L－1DADS 作用人白血病 K562 细胞24 h后蛋白 Rac2的表达水平明显上调(P＜0.05)。这些研究结果表明DADS诱导K562细胞凋亡的过程中有NADPH氧化酶的活化。

有研究表明，NADPH氧化酶有6个亚基，在NADPH氧化酶活化过程中，Rac2与p67phox结合是NADPH氧化酶的活化非常关键的环节［12］。因此我们应用免疫共沉淀方法来检测DADS诱导K562细胞凋亡的过程中Rac2与p67phox是否结合，进一步研究在DADS诱导人白血病K562细胞凋亡过程中，是否有NADPH氧化酶的活化。免疫共沉淀结果显示，通过用Anti-Rac2沉淀K562细胞的裂解蛋白，Westernblot检测到p67phox存在。实验结果表明在DADS诱导的K562细胞凋亡过程中，有Rac2和p67phox的结合，也进一步说明有NADPH氧化酶的活化。

Fig 4 Flow cytometry analysis of percentage of apoptosis cells in K562 cells

Fig 5 Flow cytometry analysis DCF fluorescence intensities of K562 cells

为进一步研究NADPH氧化酶与DADS诱导K562细胞凋亡的关系，我们采用NADPH氧化酶的激活剂PMA和NADPH氧化酶的黄素蛋白抑制剂DPI来研究NADPH氧化酶对DADS诱导K562细胞凋亡的影响。流式细胞术检测凋亡细胞百分率结果显示，PMA与DADS联合处理组凋亡细胞百分率明显高于与DADS单独处理组，而DPI与DADS联合处理组凋亡细胞百分率为明显低于DADS单独处理组。实验结果表明，PMA能明显提高DADS诱导K562细胞凋亡的作用，而DPI能抑制DADS诱导K562细胞凋亡。可见，NADPH氧化酶与DADS诱导K562细胞凋亡密切相关。

研究表明，DADS能诱导肿瘤细胞产生活性氧，产生的活性氧和肿瘤细胞的进一步的命运包括凋亡密切相关［13－14］。我们的前期研究结果显示，DADS诱导K562细胞凋亡过程中活性氧水平明显提高［7］。但是活性氧有多种来源，这些活性氧的来源并不确定，NADPH氧化酶的活化是活性氧的一个重要来源之一［15］。尽管我们的研究已经表明，在DADS诱导人白血病细胞凋亡的过程既有NADPH氧化酶的活化，又有活性氧的产生，但是NADPH氧化酶的活化是不是活性氧的主要来源还有待于进一步研究。因此我们用PMA及DPI预处理细胞，以便检测DADS诱导K562细胞凋亡过程中活性氧的水平，以确定NADPH氧化酶的活化是否DADS诱导K562细胞凋亡过程中活性氧主要来源。流式细胞术检测DCF的荧光强度结果显示，PMA明显提高了DADS诱导K562细胞活性氧的水平，而DPI预处理的细胞却没有活性氧的产生。这些结果表明，NADPH氧化酶是DADS诱导K562细胞凋亡过程中活性氧的主要来源。

NADPH氧化酶在多种肿瘤组织中的表达异于组织来源相同的正常组织，其催化产生的活性氧，可以诱导一系列细胞因子，调节细胞周期，调节肿瘤发生、发展和血管生成等等，这些为研究肿瘤发生和治疗提供了新的思路。本研究结果不仅表明DADS诱导K562细胞凋亡的过程中有NADPH氧化酶的活化，而且证实了NADPH氧化酶的活化是DADS诱导K562细胞凋亡过程中活性氧产生的主要来源。因此，NADPH氧化酶的活化在DADS诱导人白血病K562细胞凋亡中起着重要作用。当然，DADS诱导人白血病细胞凋亡的确切机制还有待于进一步研究。

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