稳定表达CRFR1的HEK293细胞株建立与功能鉴定

葛治娟，于金梅，马晓芸，刘晓燕，郑建全

(1.中南大学药学院，湖南长沙 410013;2.军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)

促肾上腺皮质激素释放因子(corticotropin releasing factor，CRF)是由41个氨基酸组成的多肽，是应激条件下的主要神经递质，在下丘脑室旁核表达量较高，并在边缘结构广泛分布［1］。CRF负责调节自主神经、免疫、生理等与应激相关的反应。CRF主要是通过与其受体结合来发挥作用，CRF受体可分为CRFR1和CRFR2两个亚型。CRFR1在哺乳动物中枢神经系统广泛分布，CRFR2主要在外周分布。脑内CRF主要与CRFR1结合产生效应［2］。目前，众多研究表明CRFR1已经成为抗抑郁症与焦虑症的潜在靶标［3］。但CRFR1介导的胞内信号通路尚不清楚，本研究试图建立稳定表达CRFR1的HEK293细胞株，为进一步阐明CRFR1信号通路和分子机制，以及筛选靶向CRFR1受体药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司;Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;牛血清白蛋白 V、胰蛋白酶(1∶250)、G418均购自 Amresco公司;TRIzol购自Invitrogen公司;RT-PCR购自北京信诺金达公司;Pierce®BCA Protein Assay Kit购自 Thermo公司;蛋白Marker购自 Fermentas公司;小鼠抗 β-actin抗体、山羊抗兔IgG/HRP二抗购自中杉金桥公司;兔抗CRFR1抗体购自Bioworld公司;近红外染料标记的二抗购自LI-COR公司;pcDNA3.1-hCRFR1质粒由UMR cDNA Resource Center提供;CRF购自Tocris公司;IBMX购自Sigma公司;LANCETMcAMP 384试剂盒购自PerkinElmer公司。BX51荧光显微镜购自OLYMPUS公司;GENios Pro多功能酶标仪购自Tecan公司;384孔酶标板购自PerkinElmer公司;Odyssey近红外双色激光成像系统购自基因有限公司。

1.2 稳定表达细胞株HEK293-CRFR1的构建将对数生长期的HEK293细胞接种于6孔板内，过夜培养，当细胞生长达80%融合时，进行转染。将hCRFR1质粒DNA与脂质体混合物加入待转染的HEK293细胞中。4 h后换完全培养基继续培养。48 h后换含800 mg·L－1G418的培养基筛选稳定表达株，约2周后挑取单克隆鉴定，扩大培养，换含800 mg·L－1G418的培养基维持筛选。

1.3 RT-PCR法鉴定CRFR1 mRNA的表达 收集稳定转染的HEK293-CRFR1细胞，用TRIzol法提取细胞总RNA。以反转录反应合成的cDNA为模板，用CRFR1引物进行PCR扩增。PCR扩增程序设为:95℃预变性5 min，94℃ 变性1 min，55℃ 退火1 min，循环35次;最后72℃ 延伸7 min。以GAPDH为内参，PCR产物用0.016 mol·L－1琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 Western blot法鉴定CRFR1蛋白的表达 收集稳定转染的HEK293-CRFR1细胞，提取蛋白，采用BCA法进行蛋白质含量测定。取变性后的蛋白样品进行凝胶电泳，电泳结束后用转膜装置进行转膜，将膜于封闭液中封闭1 h。加一抗后，4℃孵育过夜。近红外染料标记的二抗于37℃孵育1 h，用Odyssey近红外双色激光成像系统分析。

1.5 免疫荧光法评价CRFR1的转染效率及表达将转染好的细胞提前24 h接种于24孔板中。冰甲醇固定30 min，PBS漂洗，FBS 4℃封闭。加入HA一抗，4℃过夜，红色标记的荧光二抗室温避光孵育60 min，PBS漂洗，用荧光显微镜进行图像采集。

1.6 CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的量效曲线 按照LANCETMcAMP 384试剂盒说明书操作，将稳定转染的HEK293-CRFR1细胞于培养皿(d=6 cm)中培养，至融合度为85%时，用无酶的消化液于37℃消化细胞，加入HBSS终止消化，1 000 r·min－1离心5min，用刺激缓冲液收集细胞，细胞悬液用cAMP抗体稀释，在384孔酶标板同CRF共同孵育30 min后，加入检测混合物，于酶标仪上测定荧光值。绘制cAMP的标准曲线及检测细胞内cAMP浓度。

2 结果

2.1 RT-PCR鉴定 CRFR1 mRNA的表达 以GAPDH作为内参，以质粒hCRFR1作为阳性对照，琼脂糖凝胶电泳结果表明，1号和2号克隆CRFR1 mRNA的表达阳性，3号和4号克隆CRFR1 mRNA的表达阴性;并且GAPDH表达量相同时，2号克隆CRFR1 mRNA的表达量最高。见Fig 1。

Fig 1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products

2.2 Western blot鉴定 HA-CRFR1蛋白表达HEK293-pcDNA3.1细胞蛋白作为阴性对照。克隆1、2、3HA-CRFR1蛋白的表达阳性，4号克隆 HACRFR1蛋白的表达阴性;在β-actin作为参照下，蛋白表达量最高的为2号克隆HA-CRFR1。与RTPCR结果相符，见Fig 2。

Fig 2 Western blot Results

2.3 免疫荧光鉴定2号克隆HA-CRFR1蛋白的表达及评价转染效率 以正常生长的HEK293细胞为阴性对照(Fig 3A)，免疫荧光显示，2号克隆CRFR1表达量较高(Fig 3B)。以未染色HEK293-CRFR1细胞为空白对照(Fig 3C)，以HA抗体免疫荧光染色的HEK293-CRFR1细胞相对空白对照评价转染效率(Fig 3D)。

Fig 3 Transfection of CRFR1 to HEK293 cells under fluorescent microscope

2.4 CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的量效曲线 用 Origin 8.0软件对 CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP作图，量效曲线拟合良好，R2=0.9967，EC50=(5.64 ±0.05)×10－10mol·L－1，见 Fig 4。

上述结果表明，HEK293-CRFR1稳定表达细胞株构建成功，并且CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP量效曲线拟合良好［EC50=(5.64±0.05)×10－10mol·L－1，n=3］，说明由 CRFR1 介导的cAMP释放评价体系构建成功。

Fig 4 CRF dose-response curve obtained with CRFR1-HEK293 cells

3 讨论

CRFR1是典型的 G 蛋白偶联受体［3］，CRFR1除了在腺垂体高表达外，在海马、杏仁核、纹状体、蓝斑和中缝背核等情感相关脑区都富含CRFR1。CRF激活 CRFR1可通过 AC-cAMP-PKA、ERK-MAPK、PLC-IP3等信号通路来发挥生物学效应［4］。目前，认为CRFR1偶联并激活多种G蛋白，并且优先偶联于Gs蛋白。CRF的诸多作用都是由Gs介导的AC-cAMP-PKA信号传导途径实现的，CRF与CRFR1结合后，通过偶联Gs蛋白激活细胞内腺苷酸环化酶，使细胞内cAMP含量增加，从而激活蛋白激酶A，引发一系列生物效应［5］。CRF诱导cAMP产生，可在表达CRFR1的HEK293细胞上检测。通过比较药物诱导cAMP产生的半数有效浓度可比较不同药物间的差异［6］。

本实验Western blot、RT-PCR、免疫荧光的数据表明，稳定表达CRFR1的HEK293细胞株构建成功，并且HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的量效曲线［EC50=(5.64 ±0.05)×10－10mol·L－1，n=3］拟合良好［4］，说明评价体系构建成功。实验中以HEK293细胞为载体进行转染，研究发现，在正常的HEK293细胞中，Northern blot杂交实验可检测到2.7 kb CRFR1 mRNA的条带。但目前还没有数据证明 HEK293细胞中有 CRFR2的表达。尽管HEK293细胞中有CRFR1的表达，但转染后的受体表达量比本体受体表达量高出40～400倍，因此，内源受体表达CRFR1的影响可以忽略［7］。近来的研究发现，大多数G蛋白偶联受体本身具有固有活性，即没有激动剂条件下，受体自发的维持和激活下游信号传导通路的活性。研究表明，受体在细胞中的表达量增加，受体对于激动剂的反应和无激动剂条件下受体的固有活性也增加［8］。因此，本实验中，由于受体固有活性的影响，以 CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP为参照标准，可通过比较HEK293-CRFR1细胞株cAMP响应的差异，筛选CRFR1受体激动剂。并且CRFR1拮抗剂类药物对于HEK293-CRFR1细胞被内源性配体激活释放cAMP的影响，可用来筛选受体拮抗剂，并可用于进一步研究CRFR1受体后信号转导通路［9］。

临床研究表明，长期慢性应激会增加脑脊液中CRF表达量，与 CRFR1结合导致促肾上腺皮质激素分泌过多，使糖皮质激素受体介导的HPA负反馈回路发生障碍，并持续亢进，从而导致抑郁症一类的精神疾病的发生［10］。大量的数据表明，CRF系统在应激反应的调控中起重要作用［11］，CRFR1拮抗剂对不同的动物抑郁模型有抗抑郁作用。因此，人们越来越重视CRF受体拮抗剂治疗作用的研究，开发新药治疗应激相关的疾病如抑郁症、焦虑症［12］。许多CRFR1拮抗剂类药物进入临床研究，但目前取得的结果却不容乐观。目前，应用的CRFR1拮抗剂大多有相似的化学结构，因此，找到更多不同的CRFR1拮抗剂类化合物，开发特异性CRFR1激动剂能为我们治疗应激相关病症提供良好的前景［13］。

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