4－苯基丁酸对糖尿病大鼠的心脏保护作用

2014-12-07何玉莲

中国药理学通报 2014年8期

何玉莲，熊燕，张梅

(广州医科大学药学院1.蛇毒研究所、2.药理学教研室，广东广州 510082)

糖尿病患者易并发心血管疾病，其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)是患者的主要致死原因之一。DCM是由糖尿病引起的独立于高血压和冠心病，且不能用其他危险因子解释的特殊心脏疾病，主要表现为心脏舒张和收缩功能障碍以及心脏微细结构的改变，最终导致充血性心力衰竭［1］。目前，降血糖仍是DCM治疗的基础，调血脂药物、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体拮抗剂和β受体阻滞剂等仍作为目前治疗DCM的主要药物，均能够在糖尿病人中发挥一定程度的心肌保护作用并延缓DCM进展。最近的流行病学调查显示，我国的糖尿病人数已达到9 200万，糖尿病前期患者高达1.4亿［2］。因此，面对逐年增长的糖尿病发病率，寻找新的治疗药物及靶点已成为医学研究的紧迫任务。

4-苯基丁酸(4-phenyl butyric acid，4-PBA)是美国FDA在1996年批准上市的新药，最早作为特殊的氨类清除剂用于治疗慢性尿素循环紊乱［3］。近年研究发现，4-PBA可恢复肥胖所致2型糖尿病动物的血糖水平，改善胰岛素敏感性，降低糖尿病小鼠肝脏脂质沉积等作用［4］。此外，文献报道4-PBA可对抗阿霉素诱导的心脏损伤［5］。故本研究拟利用建立的1型糖尿病大鼠模型，观察4-PBA对糖尿病动物心功能的保护效应，并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1 动物 ♂Sprague-Dawley(SD)大鼠为SPF级，体质量(200±20)g，购于广东省医学实验动物中心(SCXK粤2008－0002)。

1.2 药品与试剂 4-PBA购自上海Adamas-beta公司，链脲佐菌素为Sigma公司产品，总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、总一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)和一氧化氮(nitric oxide，NO)测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品，BCA蛋白浓度测定试剂盒购于碧云天生物技术公司。

1.3 仪器设备血糖检测仪(强生公司)，PowerLab数据采集分析系统(Labchart7，AD instruments，Australia)，PowerLab八道电生理记录仪(AD instruments，Australia)，多功能全波长酶标仪(Epoch，Biotek，USA)，紫外分光光度计(Smart SpecTMplus，Bio-rad，America)。

2 方法

2.1 1型糖尿病大鼠模型制备及饲养 SD大鼠饲养在自由饮水和进食(12 h开灯和12 h闭灯)的环境，室温和相对湿度分别维持在(22±2)℃和(45±5)%，适应性喂养1周后，随机分成3组:对照组、糖尿病组、糖尿病+4-PBA治疗组。大鼠空腹状态下一次性腹腔注射链脲佐菌素(60 mg·kg－1，溶于pH 4.5的0.1 mol·L－1柠檬酸盐缓冲液)，72 h后测空腹血糖，凡连续两次测得隔日随机血糖≥16.7 mmol·L－1，即可认为糖尿病建模成功。第5周开始每天给予糖尿病大鼠4-PBA(1 g·kg－1)灌胃，对照各组动物分别给予相应的溶媒灌胃，连续治疗20周后结束实验。

2.2 大鼠大动脉和左心室血流动力学测定异氟烷吸入全身麻醉后，大鼠仰卧固定，颈部皮肤去毛，PE50导管注满0.1%肝素，与PowerLab系统相连，桥式放大器调零。经右颈总动脉切口插入PE50导管，深入1.5 cm左右停留3 min以记录大动脉内血流和压力变化，继续插入，同时观察屏幕上的波形，当波幅明显增大且导管剧烈抖动时，表明导管已进入左心室。实验数据由PowerLab八道电生理记录仪自动采集，实验完成后经PowerLab数据分析系统获得大动脉和左心室血流动力学参数。

2.3 大鼠血清及心脏组织生化指标测定完成血流动力学测定后收集大鼠血液和心脏样本。血液凝固后3 000 r·min－1离心10 min获取血清样本。心肌组织冰浴下匀浆，3 000 r·min－1离心10 min取上清液作为样本。采用羟胺法测定血清及心脏组织中SOD活力;硫代巴比妥酸法测定血清及心脏组织中MDA含量;化学比色法测定血清及心脏组织中NOS活力;硝酸还原酶法测定心脏组织中NO含量。测定方法按试剂盒说明书进行。

2.4 统计学处理实验数据经统计软件SPSS 14.0进行分析，用±s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验，用最小有意义差异检验(least significant difference，LSD和SNK)进行均数间的多重比较，每组实验均重复5次。

3 结果

3.1 4-PBA对糖尿病大鼠血糖、体重、心脏重量和心指数的影响 Tab 1数据显示，糖尿病大鼠血糖明显升高、体重明显减轻和心指数增加(P＜0.05)，但4-PBA治疗对糖尿病大鼠血糖、体重和心指数均无明显影响(P＞0.05)。

3.2 4-PBA对糖尿病大鼠大动脉和心脏血流动力学的影响

3.2.1 4-PBA对糖尿病大鼠大动脉血流动力学的影响 Tab 2数据显示，糖尿病大鼠的大动脉收缩压、舒张压和平均动脉压较正常大鼠相比均明显降低(P＜0.05)，4-PBA治疗可轻度升高糖尿病大鼠大动脉收缩压、舒张压和平均动脉压(P＞0.05)。

Tab 1 Effect of 4-PBA on blood glucose，body weight，heart weight and heart index(±s，n=5)

Blood glucose was measured by colorimetry.4-PBA，which was administrated at fifth week after diabetic model were established，was used to treat diabetic rats for 20 weeks by P.O.*P＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control.

Control T1DM 4-PBA+T1DM Blood glucose/mmol·L －1 5.38±1.58 29±5.30＊＊2.72 ±0.22 25.84 ±6.11 Heart weight/mg 1196.64 ±166.72 911.33 ±123.82* 927.26 ±90.00 The body weight/g 570.8±93.30 339.50 ±52.98＊＊ 343.60±47.31 Index of heart weight/mg·g－1 2.10±0.12 2.69±0.13＊＊

Tab 2 Effect of 4-PBA on hemodynamics of main artery in diabetic rats(±s，n=5)

Hemodynamic parameters of main artery were measured by the PowerLab system.Diabetic rats were given the same treatment as before.*P ＜0.05 vs control.

Control T1DM 4-PBA+T1DM Systolic pressure/kPa 17.16 ±1.16 12.52 ±1.81*11.17 ±0.79 13.1 ±0.95 Diastolic pressure/kPa 13.45 ±1.47 9.44 ±2.06* 9.90 ±0.70 Mean pressure/kPa 15.22 ±1.24 10.86 ±2.08* 11.50 ±0.84 Mean diastolic pressure/kPa 14.28 ±1.38 10.55 ±2.26*

3.2.2 4-PBA对糖尿病大鼠心脏血流动力学的影响 Tab 3数据显示，与正常大鼠相比糖尿病大鼠的心率、左心室收缩压、左心室内压最大上升和下降速率(±dp/dt)降低，而左心室舒张压升高，左心室收缩和舒张时程、循环时间和左心室弛缓时间延长(P＜0.01)。4-PBA治疗可轻度改善糖尿病大鼠血流动力学参数(P＞0.05)，但明显缩短左心室弛缓时间(P＜0.05)。

3.3 4-PBA对糖尿病大鼠血清和心肌组织生化功能的影响

3.3.1 4-PBA对糖尿病大鼠血清和心肌组织SOD和MDA的影响与正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌组织SOD活力明显降低，并且MDA含量明显增加，4-PBA治疗能够明显升高糖尿病大鼠心肌组织SOD活力，降低MDA含量(Fig 1A、1C)。与之一致的是，糖尿病大鼠血清中SOD活力也明显降低，MDA含量明显增加，4-PBA治疗明显改善血清这一生化改变(Fig 1B、1D)。

3.3.2 4-PBA对糖尿病大鼠血清和心肌组织NOS和NO的影响与正常大鼠相比，糖尿病大鼠心肌组织NOS活力和NO含量明显降低，4-PBA治疗能够明显升高糖尿病大鼠心肌组织NOS活力和NO含量(Fig 2A、2C)。与正常大鼠相比，糖尿病大鼠血清NOS活力无明显变化，但血清NO含量明显下降(Fig 2B、2D)，4-PBA治疗可明显升高糖尿病大鼠血清NO含量。

Fig 1Effect of 4-PBA on the activity of SOD and the level of MDA in the heart and serum of diabetic rats(±s，n=5)

Tab 3 Effect of 4-PBA on hemodynamics of left ventricular in diabetic rats(±s，n=5)

Hemodynamic parameters of left ventricular were measured by the PowerLab system.Diabetic rats were given the same treatment as before.Max pressure:systolic pressure of left ventricular;Min pressure:diastolic pressure of left ventricular;EDP:end-diastolic pressure of left ventricular;Mean pressure:mean pressure of left ventricular;Max dp/dt:maximum left ventricular pressure increase rate;Min dp/dt:minimum left ventricular pressure decrease rate;IRP Average dp/dt:period of isovolumic relaxation average dp/dt;Tau:left ventricular relaxation time constant.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs T1DM group.

Control T1DM T1DM+4-PBA Heart rate/BPM 472.22±47.88 330.79±40.25＊＊355.17±34.32 Max pressure/kPa 18.53±0.48 12.55±0.91＊＊ 13.52±1.52 Min pressure/kPa 0.09±0.01 1.16±0.58＊＊ 1.07 ±0.48 Mean pressure/kPa 9.88±0.20 7.36±0.98＊＊ 7.97 ±0.91 EDP/kPa 3.30±0.56 3.18±0.40 3.32 ±0.41 Systolic duration/s 0.079±0.007 0.11±0.014＊＊ 0.11±0.012 Diastolic duration/s 0.049±0.0050 0.073 ±0.011＊＊ 0.064±0.0069 Cycle duration/s 0.128±0.012 0.18±0.025* 0.17±0.017 Max dp/dt/kPa·s－1 1452.17±56.49 1188.66±21.93＊＊ 1245.02±81.11 Min dp/dt/kPa·s－1 －1390.01±42.57 －1147.48±23.85＊＊－1189.76±48.76 IRP Average dp/dt/kPa·s－1 －492.64±58.57 －221.75±26.36＊＊－281.18±44.37 Tau/s 0.40±0.70 2.15±1.96＊＊ 1.42±1.57#

4 讨论

Rubler在1972年观察到一些成年糖尿病患者在无明显冠状动脉和心瓣膜病变以及高血压等心血管危险因素存在的情况下，罹患充血性心力衰竭，认为这是一类特异性继发于糖尿病的心肌病变，从而首次提出DCM的概念。进一步的流行病学调查、临床和实验研究结果均显示糖尿病人确实存在特异性心肌病变。DCM的形成是一个慢性复杂的过程，糖尿病动物模型研究发现，动物在诱发糖尿病14周后方可出现较稳定的心功能紊乱表现［6］。本研究使用STZ诱导并建立大鼠1型糖尿病模型，血流动力学检测结果显示，建模后24周的糖尿病大鼠大动脉收缩压和舒张压、心率、左心室收缩压、±dp/dt均明显降低，而左心室舒张压明显升高，左心室收缩和舒张时程、循环时间和左心室弛缓时间明显延长，说明病程半年左右的糖尿病大鼠已经出现明显心脏收缩和舒张功能障碍。4-PBA治疗20周可改善糖尿病大鼠的各项血流动力学参数，尤其是可明显缩短糖尿病大鼠左心室弛缓时间，表明4-PBA能够减轻糖尿病大鼠心脏舒张功能障碍。

Fig 2Effect of 4-PBA on the activity of NOS and the level of NO in the heart and serum of diabetic rats(±s，n=5)

糖尿病人体内氧化应激明显增强，并且参与了其心血管并发症的发生发展。本研究显示糖尿病大鼠血清和心肌组织的SOD活力明显降低，MDA含量明显增加，也再次证明糖尿病大鼠体内氧化应激增强，而4-PBA治疗可明显升高糖尿病大鼠血清和心肌组织SOD活力，降低MDA含量，表现出良好的抗氧化作用，说明4-PBA可减轻糖尿病动物体内的氧化损伤。糖尿病时高血糖是氧化应激的重要诱发因素，研究报道4-PBA可降低2型糖尿病动物的血糖水平［4］。但本研究显示，4-PBA对1型糖尿病大鼠血糖水平和体重均没有影响，提示其抗氧化作用可能通过其他机制，而与大鼠血糖水平无关。一氧化氮作为心血管系统重要的内源性保护因子，具有抑制血小板聚集和血管平滑肌增生，调节血管张力和清除氧自由基等作用。实验数据显示，糖尿病大鼠心肌组织NOS活力和NO含量明显降低，4-PBA治疗能够明显升高糖尿病大鼠心肌组织NOS活力和NO含量，这一结果提示4-PBA的心脏保护作用可能与其促进心肌NO生成有关。

4-PBA是一种短链脂肪酸，具有调节内质网应激(作为分子伴侣)和抑制去乙酰化酶的作用，近年来广泛用于糖尿病以及代谢性疾病的研究［4，7－9］。4-PBA可降低自发性2型糖尿病大鼠左心室舒张末压，改善糖尿病大鼠心脏舒张功能，这一作用与其抑制内质网应激反应有关［7］。在1型糖尿病大鼠肾病研究发现，4-PBA通过调节内质网应激和减轻氧化损伤抑制糖尿病肾病的进程［8］。此外，4-PBA尚对非酒精性脂肪肝具有良好的保护作用［9］。本研究发现4-PBA可以改善1型糖尿病大鼠的心脏血流动力学，缓解心脏舒张功能障碍，这一作用可能与其抑制糖尿病动物体内氧化应激和促进心肌NO生成有关。综上所述，4-PBA作为一个多靶点药物，其对糖尿病及其并发症和代谢性疾病的防治表现出较好的疗效，而本研究也证明了4-PBA可以改善1型糖尿病大鼠的心功能，具有防治糖尿病心脏并发症的潜能，但有关4-PBA抗氧化作用和心脏保护机制尚需在以后的研究中深入探讨。

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