5－氨基乙酰丙酸辅助二甲双胍的降血糖作用

2014-12-07姜华凤曹水江范思祥仲婷婷张象威

中国药理学通报 2014年8期

姜华凤，曹水江，沈峰，侯杰，汤雷，范思祥，仲婷婷，张象威，曹莉

(1.苏州大学药学院药理学教研室，江苏苏州 215123;2.第二军医大学长征医院南京分院普外科，江苏南京 210015)

5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，5-ALA)是四氢吡咯的前缀化合物，是生物体合成叶绿素、血红素、维生素 B12等必不可少的物质［1］。以往5-ALA作为一种环境相容性及选择性很高的新型光活化植物生长调节剂，在农业领域应用非常广泛［2－4］。医药学领域则大多将5-ALA作为一种新型光动力药物，用于美容及局部或全身的皮肤疾病的治疗［5－6］。近年来，有临床研究报道，5-ALA 可延缓糖尿病前期病程的发展，改善糖尿病前期病人的糖耐量［7－8］。我们前期的研究结果显示，单独用5-ALA对STZ所致糖尿病小鼠的空腹血糖的影响不明显。本研究在临床报道和前期试验的基础上，观察5-ALA与二甲双胍(metformine，Met)联合用药的降血糖作用，并初步探讨其机制。

1 材料

1.1 药物与试剂 5-ALA，苏州益安生物科技有限公司，批号:20130127;链脲菌素(STZ):美国Sigma公司，临用前用0.1 mol·L－1柠檬酸缓冲液(pH 4.4)配成1%的STZ溶液;Met:北京中惠药业有限公司;柠檬酸亚铁(FC):郑州仁诚化工产品有限公司;葡萄糖氧化酶试剂盒:上海荣盛生物药业有限公司;葡萄糖注射液:中国大冢制药有限公司。

2 方法

2.1 小鼠糖尿病模型制备及给药小鼠按150 mg·kg－1体重腹腔注射STZ，72 h后测空腹血糖，血糖值在11.1 mmol·L－1以上的即为糖尿病造模成功小鼠。随机为5组，每组10只:模型组、Met组(334 mg·kg－1)、5-ALA 大剂量 +Met组(5-ALA 16.8 mg·kg－1+Met 334 mg·kg－1)、5-ALA 中剂量 +Met组(5-ALA 8.4 mg·kg－1+Met 334 mg·kg－1)、5-ALA 小剂量 +Met组(5-ALA 4.2 mg·kg－1+Met 334 mg·kg－1)。另取10只同批健康小鼠作为正常对照组。连续灌胃给药30 d。

2.2 样品制备及检测给药过程中监测基本体征。末次给药前禁食8h，给药后30min，眼球后静脉丛取血，用葡萄糖氧化酶法测血糖，并留取血浆，用放免法测胰岛素、瘦素(由北京华英生物技术研究所检测)，根据通用方法计算胰岛素抵抗指数(HOMA insulin resistance index，HOMA-IR)、胰岛素敏感指数(HOMA insulin sensitivity index，HOMA-ISI)、β 细胞功能指数(HOMA β-cell function index，HOMA-β)、定量胰岛素敏感性检测指数(quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI)［9］。

2.3 糖耐量实验另取一批小鼠，造模及给药同“2.1”。末次给药30 min后，给小鼠灌胃葡萄糖溶液(2 g·kg－1)，分别于0、30、60、120 min 取血，检测各时间点血糖值，计算血糖曲线下面积(area under the curve，AUC)，计算方法:分别为 0、30、60、120 min 血糖值)［10］。

2.4 组织病理学样本制备动物放血处死后，取出肝脏、胰腺，10%福尔马林液固定1个月，石蜡包埋，HE染色，光学显微镜下观察，拍照。

2.5 统计学方法所有数据均用SPSS 13.0软件进行统计。两组间比较用方差分析(ONE WAY ANOVA)中的最小明显差法(LSD)。

3 结果

3.1 5-ALA和Met对STZ致糖尿病小鼠基本体征的影响模型组小鼠毛色枯槁，垫料潮湿，30 d平均体重仅增加1.47 g。给药各组小鼠毛色均较模型组好，垫料潮湿情况较模型组减轻，平均体重增加均为6 g以上;12 h饮水量较模型组有所减少，添加5-ALA治疗组基本体征改善更为明显，见Tab 1。

Tab 1 Influence of 5-ALA and Met on body weight and water intake in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Group Dose/mg·kg－1 12 h Water Weight/g Before dosing After dosing Δvalue /ml Control － 28.42 ±2.51 48.18±2.97 19.76 4.7 Model － 28.46 ±2.53 29.93±4.47 1.47 26.8 Met 334 28.64 ±2.58 34.91 ±2.28 6.27 22.1 5-ALA+Met 4.2+334 28.81 ±2.07 35.02 ±3.65 6.21 21.4 5-ALA+Met 8.4+334 28.88 ±2.30 35.16 ±3.42 6.28 19.7 5-ALA+Met 16.8+334 28.25 ±2.99 35.21 ±3.22 6.96 18.2

3.2 5-ALA和Met对STZ致糖尿病小鼠空腹血糖、血浆胰岛素、瘦素及胰岛素敏感性的影响如Tab 2所示，给药各组空腹血糖均较模型组明显下降(P＜0.05)，添加5-ALA治疗组比单用Met组血糖下降更为明显，且呈现5-ALA的剂量依赖性，添加5-ALA大、中剂量组与单用Met组比较，差异有显著性(P＜0.05)。

模型组小鼠空腹血浆胰岛素和瘦素均较正常对照组明显升高(P＜0.05)。Met组血浆胰岛素水平较模型组明显升高(P＜0.05);添加5-ALA各治疗组血浆胰岛素水平与模型组差异无显著性，而中、大剂量组较单用Met组降低(P＜0.05)。除添加小剂量5-ALA组外，各治疗组血浆瘦素水平较模型组明显降低(P＜0.05)，见 Fig 1、2。

单用Met组小鼠除HOMA-β较模型组明显增高外，其他胰岛素敏感性指标与模型组比较差异无显著性(P＞0.05);而添加5-ALA治疗组胰岛素敏感性指标与模型组比较差异均有显著性(P＜0.05)，见 Tab 3。

Tab 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum glucose in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs Model;ΔP ＜0.05 vs Met

Group Dose/mg·kg－1 Glucose/mmol·L －1 Before dosing After dosing Control － 4.17 ±0.50 4.59 ±0.48 Model － 18.69 ±3.26 22.46 ±3.49 Met 334 18.32 ±3.09 16.41 ±3.27*5-ALA+Met 4.2+334 18.46 ±3.81 14.22 ±4.19*5-ALA+Met 8.4+334 18.07 ±3.36 12.07 ±3.06* Δ 5-ALA+Met 16.8+334 18.57 ±3.82 10.94 ±4.21*Δ

Fig 1 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum insulin in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

Fig 2 Influence of 5-ALA and Met on fasting serum leptin in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

3.3 5-ALA和Met对STZ致糖尿病小鼠糖耐量的影响给药各组糖耐量均较模型组明显改善，添加5-ALA治疗组较单用Met组糖耐量改善更为明显，且呈现明显的5-ALA剂量依赖性。添加5-ALA大、中剂量组与单用Met比较，曲线下面积AUC明显减小，见Tab 4。

3.4 5-ALA和Met对STZ致糖尿病小鼠肝脏及胰腺组织形态学影响模型组小鼠肝脏肝细胞索排列紊乱，窦间隙消失，肝实质细胞可见空泡样变。给药各组肝细胞排列均未见异常，单用Met组和添加5-ALA小剂量组，窦间隙较宽，见Fig 3。

Fig 3 Influence of 5-ALA and Met on liver tissues in diabetic mice induced by STZ

正常组小鼠胰腺中胰腺组织均匀，胰岛饱满，胰岛内细胞结构完整，细胞间界限清晰，胞核呈卵圆形，胞质均匀饱满。模型组小鼠胰腺组织疏松，胰岛数量较正常组明显减少，胰岛中细胞数量也明显减少，细胞间界限不清，细胞体积缩小，形态不规则，胞质减少，胞核固缩;单用Met组胰岛数量与模型组相似，但胰岛中细胞胞质较模型组饱满;添加5-ALA各治疗组胰岛数量均较模型组和单用Met组明显增多，胰岛中细胞形态趋于正常，且呈现出一定的5-ALA剂量依赖性，见Fig 4。

Fig 4 Influence of 5-ALA and Met on pancreas tissues in diabetic mice induced by STZ

4 讨论

5-ALA广泛分布于各种生物中，通常由琥珀酰CoA与甘氨酸合成，然后脱水缩合生成胆色素原，后者成为血红素、叶绿素、胆色素、维生素B12等四吡咯化合物生物合成的中间产物，参与氧的运输、生物合成、能量代谢等多种重要的生理过程［11］。临床上5-ALA作为第2代光敏剂已被广泛应用于各种皮肤病、膀胱癌、尖锐湿疣、上消化道癌、直肠癌、乳腺癌、老年性黄斑变性、类风湿关节炎等疾病的治疗［12］。近年来，除了临床研究报道5-ALA可延缓糖尿病前期病程的发展外，有学者在研究由于5-ALA脱水酶缺乏而造成的卟啉症的同时，发现5-ALA与糖代谢有着密切的关系［13］。大鼠口服5-ALA可抑制糖异生和糖原分解［14］。

Tab 3Influence of 5-ALA and Met on insulin-sensitivity in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs Model;ΔP ＜0.05 vs Met

Group Dose/mg·kg－1 Ln(HOMA-IR) Ln(HOMA-ISI) Ln(HOMA-β)0.52 ±0.009 Model － 3.02 ±0.348 －6.13 ±0.348 3.27 ±0.202 0.38 ±0.023 Met 334 2.92 ±0.188 －6.03 ±0.188 3.80 ±0.224* 0.38 ±0.011 5-ALA+Met 4.2+334 2.73 ±0.217 －5.97 ±0.217 3.87 ±0.418* 0.39 ±0.024*5-ALA+Met 8.4+334 2.52 ±0.276*Δ －5.64 ±0.276*Δ 4.00 ±0.421* 0.41 ±0.021*Δ 5-ALA+Met 16.8+334 2.36 ±0.199*Δ －5.24 ±0.199*Δ 4.25 ±0.457*Δ 0.42 ±0.015*Δ QUICKI Control － 1.32 ±0.077 －4.45 ±0.077 6.13 ±0.470

Tab 4Influence of 5-ALA and Met on glucose tolerance in diabetic mice induced by STZ(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs Model;ΔP ＜0.05 vs Met

Group Dose/mg·kg－1 Glucose/mmol·L －1 0 min 30 min 60 min 120 min AUC/mmol·h·L －1±1.28 21.41 ±3.29 Model － 20.70 ±3.49 23.12 ±2.61 25.94 ±3.87 23.76 ±3.55 71.89 ±9.43 Met 334 15.78 ±2.60* 17.14 ±3.74* 20.55 ±4.07 19.85 ±4.37 55.50 ±10.57*5-ALA+Met 4.2+334 14.57 ±3.94* 16.88 ±3.54* 21.13 ±4.21 17.64 ±4.55* 54.12 ±12.10*5-ALA+Met 8.4+334 11.26 ±3.19*Δ 15.11 ±3.72* 20.01 ±4.32* 16.51 ±4.97* 47.98 ±15.59* Δ 5-ALA+Met 16.8+334 10.49 ±3.71*Δ 11.58 ±4.70*Δ 18.85 ±4.46* 15.87 ±4.79* 42.82 ±13.49*Δ Control － 4.41 ±0.42 7.00 ±1.37 9.53 ±1.78 5.35

本研究根据国外临床经验，在前期研究的基础上，观察5-ALA与Met联合用药的降血糖作用。结果显示:添加5-ALA的治疗组不仅比单用Met组小鼠整体状态和糖尿病症状改善更为明显，且其空腹血糖、糖耐量实验的曲线下面积均明显降低，血浆胰岛素、瘦素水平有所下降，胰岛素敏感性改善也更为明显。添加5-ALA的各治疗组胰岛数量均较模型组和单用Met组增多，肝组织和胰岛中细胞形态趋于正常，且呈现出一定的5-ALA剂量依赖性。尽管有许多研究提出Met可改善胰岛素抵抗［15］，但其降血糖作用还主要依靠促进胰岛β细胞分泌胰岛素，在增强其代偿功能的同时，无疑加重了胰岛β细胞负担，所以Met组大鼠在表现出高血浆胰岛素水平的同时，胰岛β细胞的形态并未得到明显改善。而加用5-ALA的糖尿病大鼠，其机体胰岛素敏感性和瘦素抵抗得到进一步改善，相对减轻了胰岛β细胞负担，保护了胰岛的形态与功能，同时一定程度上缓解了机体的高胰岛素、高瘦素状态。本研究结果提示:5-ALA可通过提高胰岛素敏感性、改善瘦素抵抗及保护肝脏和胰岛的形态与功能等机制，明显增强Met的降血糖、改善糖耐量的作用。

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