miR－181a对乳腺癌耐药蛋白表达调控作用的研究

林 姝，焦旭阳，赵 琳，魏敏杰

(中国医科大学药学院药理学教研室，辽宁沈阳 110001)

乳腺癌是最常见的女性恶性肿瘤，严重威胁患者生命和生活质量。化疗在乳腺癌的综合治疗中起着不可替代的作用，但治疗中出现的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)严重影响了临床疗效及患者预后。在 MDR形成的过程中，P-gp、MRP、BCRP和LRP作为转运蛋白在肿瘤MDR产生中发挥重要作用［1］。乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein，BCRP)作为一种重要的转运蛋白，是从耐药的人乳腺癌细胞株MCF7/Adr中用RNA指纹分析法分离出的一种转运蛋白，包含有2.4kb mRNA翻译的655个氨基酸残基，含有1个ATP结合域和1个疏水性跨膜结构域，其基因定位于人染色体4q22［2］。BCRP能够通过水解ATP供能将转运底物(化疗药物)从细胞内逆浓度梯度泵到细胞外，特异性使乳腺癌细胞内MX(米托蒽醌)、topotecan(拓扑替康)等浓度下降，从而导致细胞对药物抵抗，诱导耐药性产生。研究发现，BCRP在乳腺癌MDR 中发挥重要作用，在 MX、topotecan［3］等乳腺癌耐药细胞中均发现BCRP过表达;上调乳腺癌细胞中BCRP表达可诱导细胞对tamoxifen(他莫昔芬)、BMS-554417(IGF-1R inhibitor)等药物的耐药性［4］。乳腺癌患者BCRP mRNA水平与患者对于蒽环类抗生素治疗的反应性相关，而且，BCRP是乳腺癌干细胞的分子标记物之一［5］。因此，研究BCRP表达的靶向调控机制对于影响乳腺癌MDR具有很重要的意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是长度约22nt的内源性短链RNA，通过与目标mRNA分子的3'端非编码区域(3'UTR)特异结合后，通过转录后调控的方式抑制目的基因的翻译和表达。由于BCRP mRNA-3'UTR长度约为2kb，远长于人类mRNAs-3'UTR 的平均长度700bp［6］，提示 BCRP mRNA-3'UTR可能存在miRNA调控BCRP表达的作用靶点。

本研究通过RNAhybrid和 miRBase Targets分析，发现miR-181a的“种子区”，即5'端2～8或1～7核苷酸区与BCRP的3'UTR序列有配对，表明miR-181a可能与乳腺癌耐药细胞BCRP表达负相关。因此，本研究选择miR-181a作为研究对象，检测乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX和敏感细胞MCF-7中miR-181a的表达水平差异;通过荧光素酶报告基因分析检测miR-181a与BCRP-3'UTR的结合作用;在乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中诱导miR-181a高表达，检测BCRP表达;最后，在乳腺癌敏感细胞MCF-7中抑制miR-181a表达，反向验证miR-181a对BCRP表达的影响。通过以上研究，拟探讨miR-181a对乳腺癌细胞BCRP的调控作用及机制，为发现乳腺癌耐药性形成与逆转的新切入点提供理论与实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞 人类乳腺癌细胞MCF-7购自美国经典细胞库(ATCC)，由本实验室自行冻存。MCF-7/MX是对米托蒽醌(MX)耐药的乳腺癌细胞，由本实验室诱导。

1.2 主要试剂 高糖DMEM培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清(FBS)购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司;TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)ver 3.0试剂盒购自宝生物工程有限公司;TRIzol和LipofectamineTM2000均购自美国Invitrogen公司。鼠抗人BCRP、MRP、LRP、P-gp等单克隆抗体购自美国Abcom公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG二抗购自北京中衫金桥生物公司;PVDF膜购自宝信生物公司。miR-181a mimic、NC mimic、miR-181a inhibitor、NC inhibitor、miR-181a agmir、NC agmir等购于广州锐博生物制剂有限公司。膜蛋白提取试剂盒购自于Thermo公司。

1.3 细胞培养及转染 MCF-7、MCF-7/MX细胞用含抗生素质量分数10%FBS的高糖DMEM培养基，于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养传代。转染前1天，胰酶消化MCF-7及MCF-7/MX细胞，接种在6孔板(3×105个/孔)或10 cm培养皿(2×106个)中培养，24 h后，用不含抗生素的无血清培养基饥饿培养1 h，之后按LipofectamineTM2000转染试剂盒操作步骤分别转染miR-181a mimic，及其非特异性的阴性对照质粒NC mimic或miR-181a inhibitor及其阴性对照质粒NC inhibitor，终浓度为20 nmol·L－1。4 h后，用新鲜的含有体积分数10%FBS的DMEM培养基替换原培养基培养48 h，备用。

1.4 Luciferase荧光素酶报告分析 应用Luciferase荧光素酶报告分析，对 miRNA-181a是否与BCRP mRNA-3'UTR有结合位点进行检测。首先，采用PCR扩增BCRP mRNA-3'UTR序列片段以及miRNA-181a序列片段，插入 Luc表达载体 pGL3(Promega)，构建pEGFP-BCRP 3'UTR与pcDNA3.3-miR-181a重组质粒。应用 Lipofectamine 2000将pEGFP-BCRP 3'UTR与pcDNA3.3-miR-181a或pcDNA3.3空质粒(阴性对照)共转染入293T细胞48 h后，荧光检测仪检测荧光强度。

1.5 qRT-PCR 检测 P-gp、MRP、LRP 和 BCRP 的相对表达水平以及miR-181a的表达水平 MCF-7/MX及 MCF-7细胞分别转染 miR-181a mimic或miR-181a inhibitor后，按照RNA提取试剂盒步骤，提取 RNA，按 10 μl体系(DEPC H2O 0.45 μl，5 ×

buffer 2 μl，RRI 0.25 μl，M-MLV 0.3 μl，RT-primmer 1 μl，dNTP 1 μl，RNA 5 μl)，反应条件为:30℃，10 min;42℃，1 h，85℃，5 min;5℃，5 min;4℃，2 h，逆转录得 cDNA。再按 25 μl体系(去离子水 9 μl，2 ×SYBR Green 12.5 μl，Rox 0.5 μl，上游引物 0.5 μl，下游引物 0.5 μl，cDNA 2 μl)进行 qRT-PCR 实验，反应条件为:95℃，2 min(预变性);95℃，15 s;60℃，30 s，40 循环;95℃，1 min;55℃，30 s;95℃，30 s。实验最少重复3次，对miRNA-181a细胞内表达量以及几种耐药蛋白的mRNA进行统计分析。

1.6 Western blot检测 BCRP、P-gp、LRP、MRP蛋白的表达 MCF-7和MCF-7/MX细胞培养24 h后，将细胞用预冷的PBS洗1遍，按照膜蛋白提取试剂盒(Thermo，89826)操作，用BCA法(碧云天，P0012)进行蛋白定量。取等量蛋白样品(25 μg)，加5×上样缓冲液(20%甘油，4%十二烷基硫酸钠，10%β-巯基乙醇，0.05% 溴酚蓝，1.25 mol·L－1Tris-HCl，pH 6.8)，金属浴 95℃ 变性 10 min 后，用8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜上，用含有质量分数5%脱脂奶粉、体积分数1%吐温20的Tris-HCl缓冲盐溶液(TBST)封闭2 h，TBST冲洗3次，每次10 min，添加5种蛋白抗体:ABCG2/BCRP(Abcam，ab3380)、P-gp(Abcam，ab3366)、LRP(Santa Cruz，sc23916)、MRP(Abcam，ab24102)、βactin(Santa Cruz，sc47778)，稀释500 倍，室温孵育2 h，4℃过夜，TBST冲洗3次，每次10 min，添加二抗(中杉金桥，ZB2305)，1∶3 000稀释，室温孵育1.5 h，TBST冲洗3次，ECL发光。实验最少重复3次，测定灰度值，进行统计学分析。

1.7 统计学分析 所得结果数据用统计学分析软件SSPSS 16.0分析处理，数值用±s表示，实验最少重复3次，并用单因素方差分析方法(ANOVA)统计比较组间差异，之后用LSD事后检验。

2 实验结果

2.1 qRT-PCR检测 MCF-7细胞及 MCF-7/MX细胞中miR-181a表达水平 通过qRT-PCR检测MCF-7细胞及MCF-7/MX两种细胞中miR-181a表达水平，结果发现，与MCF-7细胞(BCRP低表达)相比，MCF-7/MX(BCRP高表达)细胞中miR-181a表达明显降低(Fig 1，P＜0.05)，表明 miR-181a的高表达与BCRP的低表达相关，提示miR-181a可能是负性调控BCRP表达的重要miRNA。

Fig 1 miR-181a expression in MCF-7 and MCF-7/MX cells(detected by qRT-PCR)*P＜0.05 vs MCF-7

2.2 生物信息学分析miR-181a靶向结合BCRP mRNA-3'UTR区 为了验证miR-181a对BCRP表达的负性调控是否与miR-181a和BCRP mRNA-3'UTR的结合作用相关，我们首先应用miRBase Targets Database(www.microrna.sanger.ac.uk)理论预测，发现包括miR-181a在内的15个microRNAs可与BCRP mRNA-3'UTR结合。进一步通过Targetscan发现BCRP mRNA-3'UTR存在miR-181a的结合位点，其中①3003bp-3025bp和②3651bp-3673bp是关键结合位点(Fig 2)。

Fig 2 Binding sites of miR-181a were predicted by Targetscan in BCRP mRNA-3'UTR

2.3 荧光素酶报告基因分析miR-181a靶向作用于BCRP mRNA-3'UTR区 进一步通过构建BCRP 3'UTR荧光素酶报告基因质粒，共转染miR-181a与BCRP 3'UTR至293T细胞中，进行荧光素酶报告基因分析，结果发现:与阴性转染组(NC mimic与PGL3-BCRP 3'UTR共转染组)相比，miR-181a mimic与PGL3-BCRP 3'UTR共转染后，荧光素酶活性明显降低(Fig 3，P＜0.05)，表明miR-181能够与BCRP mRNA-3'UTR区靶向结合。

Fig 3 Binding of miR-181a and BCRP mRNA-3'UTR region(detected by Luciferase reporter assay)

2.4 qRT-PCR、Western blot检测诱导 MCF-7/MX细胞中miR-181a过表达后BCRP等耐药蛋白mRNA及蛋白表达水平变化 接下来，通过诱导miR-181a高表达，检测乳腺癌细胞BCRP表达的变化，考察miR-181a对BCRP表达的负性调控作用。首先，我们将miR-181a mimic转染到MCF7/MX耐药细胞中，48h后，通过qRT-PCR检测发现，与NC mimic转染组相比，转染 miR-181a mimic后导致miR-181a低表达的MCF-7/MX细胞中miR-181a的表达增加约100倍(Fig 4，P＜0.05)，表明转染miR-181a mimic成功诱导MCF-7/MX细胞miR-181a高表达。观察miR-181a过表达的MCF-7/MX细胞中BCRP、MRP、LRP、P-gp的 mRNA 及蛋白表达水平变化。结果发现，与NC mimic转染组相比，miR-181a mimic转染诱导miR-181a过表达后，可抑制BCRP表达，通过qRT-PCR检测发现，miR-181a过表达的MCF-7/MX细胞BCRP mRNA表达明显下降(Fig 5，P＜0.05)。进一步通过 Western blot检测发现，BCRP蛋白表达亦明显下降(Fig 6A、B，P＜0.05)，而MRP、P-gp、LRP等耐药蛋白的mRNA表达和蛋白水平均无明显改变(Fig 5、Fig 6，P＞0.05)，说明miR-181a具有选择性靶向抑制BCRP表达的作用。

2.5 抑制MCF-7中miR-181a表达可增加BCRP表达 以上研究结果提示，诱导miR-181a高表达可靶向抑制MCF-7/MX乳腺癌耐药细胞BCRP表达。为了验证抑制乳腺癌药物敏感细胞MCF-7(miR-181a高表达)中内源性miR-181a表达，能否会增加BCRP表达，我们将miR-181a inhibitor转染至MCF-7细胞，构建miR-181a低表达的MCF-7细胞模型，检测BCRP表达，反向验证miR-181a对BCRP表达及功能的靶向调控作用。转染48 h后，我们通过qRT-PCR法检测miR-181a在MCF-7中的表达水平，与NC inhibitor转染组相比，miR-181a inhibitor转染的MCF-7细胞中，miR-181a的表达降低了5倍左右(Fig 7，P＜0.05)，说明 miR-181a inhibitor转染可抑制MCF-7细胞中内源性miR-181a表达。通过qRT-PCR检测发现，使MCF-7细胞miR-181a低表达后，BCRP mRNA表达明显增加(Fig 8，P＜0.05)。进一步通过Western blot检测发现，BCRP蛋白表达亦明显增加(Fig 9A、B，P＜0.05)，而 MRP、P-gp、LRP等耐药蛋白的mRNA表达和蛋白水平均无明显改变(Fig 8、Fig 9，P＞0.05)，说明抑制乳腺癌药物敏感细胞MCF-7内源性miR-181a的表达，可特异性增加BCRP表达。

Fig 4 Expression of miR-181a in MCF-7/MX cells(detected by qRT-PCR)

Fig 5 mRNA expressions of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7/MX cells(detected by qRT-PCR)

3 讨论

研究表明，miRNA可与靶基因互补结合，从而负性调控靶基因的表达与功能，因此，发现并研究具有与BCRP靶向结合及负性调控作用的miRNA，对于逆转BCRP介导的MDR具有重要意义。为了发现参与BCRP表达负性调控的miRNA，选取合适的细胞模型十分重要。以往研究发现，大多数BCRP高表达的细胞系都可由MX诱导，因此，有人把BCRP称为MX耐药蛋白。基于此，本研究选取了乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX和乳腺癌敏感细胞MCF-7进行研究。

Fig 6 Protein expression levels of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7/MX cells(detected by Western blot)

Fig 7 Expression of miR-181a in MCF-7 cells(detected by qRT-PCR)

Fig 8 mRNA expressions of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7 cells with low expression of miR-181a(detected by qRT-PCR)

Fig 9 Protein expressions of BCRP，MRP，LRP，P-gp in MCF-7 cells with low expression of miR-181a(detected by Western blot)

miR-181a最初发现于人恶性胶质瘤，发挥抑癌miRNA 功能［7］。在乳腺癌［8］、胃癌［9］miR-181a 表达升高，发挥类似癌基因的功能。此外，miR-181a与肿瘤细胞多种表型相关，如增殖［10］、凋亡［11］和耐药［12］等。有研究发现，血清中 miR-181a表达水平可用于乳腺癌的早期诊断与转移［12］和患者预后的生物标志物［13］。然而，miR-181a在乳腺癌耐药中的作用如何，目前尚不清楚。我们发现，miR-181a在MCF-7/MX耐药细胞中(BCRP高表达)下调，提示miR-181a可能参与BCRP表达的负性调控。生物信息学是预测miRNA与靶基因是否具有结合位点的有效方法，我们通过Targetscan预测miR-181a靶基因，发现BCRP是众多靶基因之一，且miR-181a与BCRP-3'UTR区具有结合位点，进一步提示miR-181a可能是负性调控BCRP表达的miRNA。

接下来我们通过qRT-PCR发现，在乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX(BCRP高表达)中miR-181a表达水平明显低于乳腺癌敏感细胞MCF-7(BCRP低表达)，进一步表明miR-181a表达可能与BCRP表达负相关。进一步通过荧光素酶报告基因分析，证实了miR-181a可与BCRP-3'UTR靶向结合，进而提示了miR-181a可能通过PTGS(post-transcriptional regulation)方式抑制BCRP表达。为了证实miR-181a与BCRP-3'UTR结合后是否可抑制BCRP表达，我们首先以BCRP过表达的MCF-7/MX乳腺癌耐药细胞为研究对象，发现给予miR-181a mimic诱导MCF-7/MX中miR-181a过表达后，可抑制BCRP表达。研究结果首次证实了miR-181a对BCRP表达的靶向调控作用。以往研究发现miR-181a一些靶基因，例如 p27［14］、RalA［10］、K-ras［15］等。我们的研究结果证实，BCRP亦是miR-181a的新的功能靶基因。那么，miR-181a对其他耐药蛋白作用如何?对BCRP表达的抑制作用是否特异?我们发现，MCF-7/MX中miR-181a过表达后，对P-gp、MRP、LRP的表达无明显影响。这些结果证实了诱导miR-181a表达可特异性抑制BCRP表达。

以上研究结果表明，miR-181a可使BCRP过表达的MCF-7/MX乳腺癌耐药细胞中BCRP表达被特异性抑制，那么，在BCRP低表达的乳腺癌敏感性细胞中(miR-181a高表达)，抑制miR-181a的表达水平，是否会引起BCRP表达变化?我们发现，乳腺癌敏感性细胞MCF-7转染 miR-181a inhibitor，使miR-181a表达下调后，细胞中BCRP表达升高。同时，与MCF-7/MX结果类似，抑制miR-181a表达，对P-gp、MRP、LRP的表达无明显影响。这个研究结果从反方向进一步证实了miR-181a对乳腺癌中BCRP表达的调控作用。

综上，我们的研究证明，miR-181a可靶向抑制乳腺癌细胞BCRP表达，提示miR-181a可能成为影响BCRP介导的乳腺癌MDR的关键靶点。

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