灵芝多糖联合二甲双胍预防糖尿病大鼠主动脉病变及对VEGF表达的影响

2014-12-07窦志华孟国梁郑惠华

中国药理学通报 2014年8期

乔进，窦志华，吴锋，孟国梁，陈惠，郑惠华

(南通市第三人民医院1.药剂科、2.药理学系，江苏南通 226001;3.江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通 226006)

糖尿病血管病变是糖尿病(diabetes mellitus，DM)慢性并发症之一，其患病、发病率高，严重危害人体健康，影响人们的生活质量，是糖尿病患者致残及死亡的首要原因。国内研究发现:首次筛查并发症的糖尿病人群中，一项及以上大血管病变患病率达 38.3%［1］。灵芝多糖(ganoderma lucidum poly- saccharide，GLPs)为真菌灵芝［Ganoderma lucidum(Leys.Ex Fr.)Karst］中提取出的以 β(1→3)糖苷键为主链的多糖［2］。二甲双胍(metformin)为临床常用降糖药之一，具有明显降糖和改善胰岛素抵抗的作用，近年来研究证实了其具有一定的防治糖尿病血管并发症和保护心血管的作用［3］。吴锋等［4］研究发现，GLPs能抑制大鼠体内氧化应激。笔者［5］证实GLPs可有效抑制血清糖基化终末产物及增强体内CAT、GSH-Px活性来保护主动脉内皮功能。联合应用这两种药物治疗糖尿病心血管疾病具有理论上的优点，即在降低血糖的同时抑制体内氧化应激水平。但两药联合应用其疗效是否优于单用，尚未见报道。本研究建立2型糖尿病大鼠模型，观察GLPs联合二甲双胍对2型糖尿病大鼠胸主动脉病变的抑制作用，探讨其可能作用机制，为临床合理应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠80只，♂♀各半，体质量160～180 g，南通大学实验动物中心提供，许可证号:FYXK(苏)2007－0021。

1.2 药品与仪器灵芝多糖(江苏安惠生物科技有限公司，批号:100601)，纯度:75.61%，以0.5%的羧甲基纤维素钠(CMC)配置成溶液;二甲双胍(上海信谊天平药业有限公司，批号:67100507);链脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)，临用前用0.1 mol·L－1柠檬酸缓冲液配成浓度为1%的STZ溶液;过氧化氢酶(CAT)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒(南京建成生物工程研究所产品);第2代免疫组化ElivisionTMplus广谱试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);兔抗VEGF多抗(武汉博士德生物工程有限公司);小鼠抗β-actin多克隆抗体(上海康成生物工程有限公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔及羊抗小鼠IgG(上海康成生物工程有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒(海门碧云天生物研究所)。One Touch血糖仪(美国强生公司);日立7170A全自动生化分析仪(日本日立公司);BH-NIC-B型倒置显微镜(日本O-lympus公司);蛋白电泳仪(美国 Bio-Rad公司);SH-100型凝胶图像分析仪(上海复旦四星高科技技术公司)。

1.3 动物分组与给药 SD大鼠80只，分为正常对照组和造模组。正常对照组10只，给予普通饲料喂养。造模组70只给予高脂饮食(基础饲料70%、脂肪20%、蛋黄粉5%、奶粉5%)，喂养4周后禁食12～14 h，予STZ 30 mg·kg－1腹腔注射。1 周后，空腹血糖值≥11.1 mmol·L－1即造模成功，继续高脂饮食。取40只成模大鼠随机分为4组:糖尿病组、灵芝多糖组(灵芝多糖600 mg·kg－1)、二甲双胍组(二甲双胍600 mg·kg－1)、联合用药组(灵芝多糖300 mg·kg－1+二甲双胍 300 mg·kg－1)。每日上午11∶00时灌胃给药，qd，正常对照组和糖尿病组予生理盐水灌胃，连续给药12周。

1.4 观察指标

1.4.1 血糖测定 12周末，禁食14～16 h，大鼠尾静脉取血测空腹血糖。

1.4.2 血清CAT、GSH-Px含量测定用CAT分解H2O2，再加入钼酸铵的方法测CAT活力，用酶促反应的速度表示GSH-Px的活力，具体操作法按试剂盒说明进行。

1.4.3 血清 TC、TG 水平测定取血，2 000 r·min－1分离血清，日立7170A全自动生化分析仪测定血清TC、TG含量。

1.4.4 病理组织学观察取胸主动脉用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片(厚度5 μm)，常规HE染色，光镜观察胸主动脉病理组织学变化。

1.4.5 免疫组化检测主动脉VEGF的表达取部分胸主动脉，4%多聚甲醛固定，24 h内石蜡包埋，切片。采用免疫组织化学法检测胸主动脉中VEGF的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。各抗体按1∶50的方法稀释，以PBS替代一抗作为阴性对照，将切片置于高倍镜下(×200)，每张切片随机选取8～10个视野，细胞胞膜和胞质内棕黄色颗粒即为阳性信号。采用JEDA801D型形态学图像分析软件测定阳性信号所占面积及平均灰度，二者乘积(即积分光密度值)越大表明组织中该抗原含量越高。

1.4.6 免疫印迹检测VEGF蛋白的表达取100 mg胸主动脉，置入组织裂解液(含有蛋白酶抑制剂)提取蛋白，BCA法蛋白定量。8%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电流100 V;300 mA转膜150 min至PVDF膜上;含有5%脱脂奶粉PBST室温封闭1 h，分别加入VEGF和β-actin抗体4℃过夜，再加相应的二抗室温反应1 h，洗膜后暗室加ECL，X线胶片曝光后显影、定影。用四星图像处理系统测定各组目的蛋白表达量与内参(β-actin)表达量的比值，取均值。

1.5 统计学分析采用Stata10.0统计软件分析处理数据，计量资料以±s表示，比较采用单因素方差分析，q检验。

2 结果

2.1 大鼠空腹血糖糖尿病组空腹血糖水平高于正常对照组，差异有显著性(P＜0.01)。用药组空腹血糖水平均低于糖尿病组(P＜0.01)，其中联合用药组下降幅度最大。见Tab 1。

Tab 1 Blood glucose in rats of each group(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs CON;##P ＜0.01 vs DM

Group Blood glucose/mmol·L －1 CON 3.51 ±0.25##DM 19.13 ±0.81＊＊GLPs 11.16 ±0.33＊＊##Met 13.77 ±0.57＊＊##COM 7.35 ±0.64*##

2.2 大鼠血清CAT、GSH-Px含量测定与正常对照组相比，糖尿病组大鼠血清CAT、GSH-Px活性降低(P＜0.01)，用药组大鼠血清 CAT、GSH-Px活性有不同程度的升高(P＜0.05)，其中联合用药组升高最为明显(P＜0.01)，效果强于单独用药组(P＜0.05)。见 Tab 2。

Tab 2 CAT and GSH-Px levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group CAT/kU·g－1 GSH-Px/kU·g －1 CON 14.21 ±2.15 2598.13 ±126.75 DM 4.24 ±0.51＊＊ 1321.12 ±108.17＊＊GLPs 8.12 ±1.23# 1759.52 ±152.16#Met 7.15 ±1.47# 1680.43 ±135.15#COM 12.19 ±1.18##△ 2212.43 ±178.41##△

2.3 大鼠血清TC、TG水平测定与正常对照组相比，糖尿病组血清TC、TG水平明显升高(P＜0.01)，与糖尿病组相比，各治疗组血清TC、TG水平明显下降(P＜0.05或P＜0.01)，与单独用药组相比，联合用药组血清TC、TG水平明显降低(P＜0.05或P＜0.01)。见Tab 3。

2.4 胸主动脉病理学变化实验结束取大鼠胸主动脉横断面切片行病理学检查，HE染色可见，正常对照组:血管内膜结构清晰，表面光滑，内皮细胞形态规则，无脱落;糖尿病组:内膜明显增厚，表面不光滑，内皮细胞突起，形态不规则，中膜明显增厚，平滑肌细胞排列紊乱;灵芝多糖组:内膜略微增厚，表面不光滑，中膜轻度增厚，平滑肌细胞排列紊乱;二甲双胍组:形态比糖尿病组略微好转，中膜未见明显增厚;联合用药组:内膜较光滑，内皮细胞排列较整齐，脂质沉积较模型组少，中膜未见明显增厚，平滑肌细胞排列较整齐，程度较糖尿病组明显减轻。见Fig 1。

Tab 3 TC and TG levels in serum in rats of each group(±s，n=10)

＊＊ P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05，△△P ＜0.01 vs Met or GLPs

Group TC/mmol·L －1 TG/mmol·L －1 CON 1.58 ±0.21 0.46 ±0.09 DM 7.54 ±0.35＊＊ 2.51 ±0.23＊＊GLPs 4.98 ±0.39# 1.59 ±0.11#Met 5.23 ±0.41# 1.61 ±0.15#COM 2.17 ±0.16##△△ 0.78 ±0.14##△

2.5 免疫组化检测胸主动脉VEGF的表达棕褐色为目标蛋白表达。与正常对照组相比，糖尿病组大鼠主动脉VEGF表达明显增强(P＜0.01)。与糖尿病组相比，3个治疗组VEGF的表达明显降低(P＜0.05)，其中联合用药组蛋白表达最低(P＜0.01)，低于单独用药组(P＜0.05)。见Fig 2、Tab 4。

2.6 蛋白印记检测胸主动脉VEGF的表达内参β-actin在各组中有均一表达，VEGF在各组中的蛋白条带深浅不一，见Fig 3。

Fig 3 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group

Tab 4 Expression of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group VEGF CON 0.35 ±0.11 DM 3.24 ±0.24＊＊GLPs 2.09 ±0.17#Met 2.16 ±0.15#COM 0.71 ±0.08##△

用四星图像处理系统测出各组蛋白表达与βactin的表达量，计算出比值。与正常对照组相比，糖尿病组大鼠主动脉VEGF表达明显增强(P＜0.01)。与糖尿病组相比，3个治疗组的蛋白表达均下调(P＜0.05)，联合用药组组下调最为明显(P＜0.01)。见Tab 5。

3 讨论

本研究通过高脂饮食配合注射小剂量STZ诱导2型糖尿病模型，联合应用灵芝多糖与二甲双胍干预，结果提示糖尿病组大鼠实验期间血糖维持高水平，联合用药组血糖明显低于模型组(P＜0.01)，并明显低于单独用药组(P＜0.05)。

Tab 5 Western blot of VEGF of aorta thoracica in rats of each group(±s，n=10)

＊＊P ＜0.01 vs CON;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs DM;△P ＜0.05 vs Met or GLPs

Group VEGF CON 0.25 ±0.01 DM 0.99 ±0.02＊＊GLPs 0.73 ±0.01#Met 0.76 ±0.02#COM 0.47 ±0.02##△

糖尿病血管病变是糖尿病常见的严重慢性并发症之一。研究表明，氧化应激及炎症反应在糖尿病发生发展中起重要作用［6］。干预氧化应激既可以消除病因，如恢复血糖、血脂水平;也可从病理环节着手，如切断氧化应激发生、消除氧化应激产物等。在体内高糖环境下，机体一方面清除氧自由基酶(CAT、GSH-Px)的活性降低，另一方面体内的氧化应激作用增强，造成了大量氧自由基在体内积聚，导致活性氧连锁反应，从而促进一系列糖尿病并发症的发生和发展［7］。同时，氧化应激的发生和发展与血清中TC、TG水平有关［8］。本研究中，糖尿病组大鼠胸血清TC、TG含量明显升高(P＜0.01)，血清CAT、GSH-Px活性明显降低(P＜0.01)。联合用药组血清 TC、TG含量明显降低(P＜0.01)，血清CAT、GSH-Px活性明显升高(P＜0.01)，效果优于单独用药组(P＜0.05)，提示在药物总的剂量不变的前提下，灵芝多糖和二甲双胍联合使用能减少TC、TG含量，即降低血脂水平，增强清除氧自由基酶的活性，抑制体内氧化应激的形成，较单独用药更好的增强机体抗氧化能力。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等致炎因子参与介导糖尿病的发生和炎症损伤［9］。因此，抑制致炎因子及其相关信号通路是防治糖尿病血管病变的重要策略之一。血管内皮细胞参与血管内外物质交换和血管新生，具有重要生理作用。血管内皮细胞损伤常常是糖尿病血管并发症和高血压等疾病的始动环节，并贯穿疾病整个过程［10］。因此，对血管内皮细胞的保护已成为治疗糖尿病大血管病变研究的重要方向。作为血管新生相关因子，VEGF是内皮细胞特异性的促有丝分裂原和趋化因子，通过促进内皮细胞增殖，加速新生血管的形成［11］。张力等［12］研究发现，VEGF与糖尿病的血管病变密切相关。VEGF属血小板源性生长因子家族，其受体仅表达于血管内皮细胞表面，能刺激血管内皮细胞的有丝分裂和血管的发生，提高单层内皮的通透性［13］，血清VEGF水平上升、血管通透性增加、血管内皮细胞功能障碍与糖尿病进程密切相关［14－15］。给药12周末，光镜下观察各组大鼠胸主动脉内膜结构发现，同等剂量的灵芝多糖于二甲双胍对主动脉内膜的保护作用相当，总药物剂量不变情况下，两种药物联合使用能增强对主动脉内膜的保护作用，结果优于单独用药。

VEGF的生物学功能主要表现在:(1)促进血管通透性;(2)促进血管内皮细胞有丝分裂，使血管生成;(3)刺激人的内皮细胞产生一氧化氮(NO)，并使其浓度呈剂量依赖性增加，起到维持血管作用;(4)促进内皮细胞增殖，加快血管内皮愈合。有研究表明:血清VEGF与血管并发症密切相关［16］。在对VEGF与大血管病变关系的研究中发现，合并有糖尿病大血管病变的患者，血清VEGF较对照组明显升高。动脉粥样斑块形成时，激发了血管内皮细胞、血小板、单核细胞等，产生大量的VEGF，同时由于动脉粥样硬化组织存在着局部缺血，而缺血、缺氧是诱发多种组织细胞分泌VEGF增加的重要原因［17］。Sun 等［18］进一步研究发现，缺氧应激可能造成细胞功能受损，部分细胞的功能代偿使VEGF表达上调，VEGF水平升高更进一步加重脂肪细胞功能障碍的二元受损。T2DM空腹VEGF水平上调，增加机体肾脏、视网膜等血管性病变的发生。Elshal等［19］研究表明链脲佐菌素建模T2DM大鼠血管通透性高，VEGF水平上升。本研究中，糖尿病大鼠血管病变的同时伴随VEGF蛋白表达的上调，证实VEGF过度表达是导致糖尿病血管病的因素之一。联合用药治疗后，大鼠主动脉VEGF的表达明显下降(P＜0.01)。总药物剂量不变情况下，联合用药对大鼠主动脉VEGF表达的抑制作用要强于单独用药组(P＜0.05)。

综上所述，在2型糖尿病大鼠模型中，联合应用灵芝多糖和二甲双胍在降血糖和改善主动脉病变程度效果优于单药使用，其机制可能与降低血脂水平、调节氧化应激、下调主动脉病变过程中VEGF的表达有关。联合这两种药物对临床治疗糖尿病有一定的指导意义。有关VEGF的表达是否为糖尿病血管病变的决定因素，联合用药在临床上的适宜剂量、可能产生的副作用在今后将做进一步研究。

［1］王玉珍，赵德明，许樟荣，等.糖尿病合并大血管病变的危险性研究4845例糖尿病患者合并慢性并发症及治疗现状调查［J］.中国糖尿病杂志，2006，14(3):197 －200.

［1］Wang Y Z，Zhao D M，Xu Z R，et al.A survey on the diabetic macrovascular complications and related risk factors in the 4845 Chinese diabetic patients［J］.Chin J Diabetes，2006，14(3):197 －200.

［2］Huang S Q，Li J W，Li Y Q，Wang Z.Purification and structural characterization of a new water-soluble neutral polysaccharide GLPF1-1 from Ganoderma lucidum［J］.Int J Biol Macromol，2011，48(1):165－9.

［3］Anfossi G，Russo I，Bonomo K，et al.The cardiovascular effects of metformin:further reasons to consider an old drug as a cornerstone in the therapy of type 2 diabetes mellitus［J］.Curr Vasc Pharmacol，2010，8(3):327 －37.

［4］吴锋，孟国梁，徐济良，等.灵芝多糖抑制NADPH氧化酶表达防治大鼠动脉粥样硬化［J］.中国药理学通报，2012，28(7):944－7.

［4］Wu F，Meng G L，Xu J L，et al.The anti-atherosclerotic effect of Ganoderma lucidum polysaccharides via down-regulation of vascular NADPH oxidases expression in atherosclerosis rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(7):944 －7.

［5］乔进，薛华，孟国梁，等.灵芝多糖对2型糖尿病大鼠胸主动脉内皮功能的保护作用［J］.中国动脉硬化杂志，2009，17(9):709－13.

［5］Qiao J，Xue H，Meng G L，et al.Protective effects of ganoderma lucidum polysaccharides on aorta pectoralis endothelial in Type2 diebetes ratsin vivo［J］.Chin J Arterioscler，2009，17(9):709 － 13.

［6］Lewis A，Steadman R，Manley P，et al.Diabetic nephropathy，inflammation，hyaluronan and interstitial fibrosis［J］.Histol Histopathol，2008，23(6):731 － 9.

［7］Johansen J S，Harris A K，Rychly D J，Erygul A.Oxidatives tress and the use of antioxidants in diabetes:Linking basic science to clinical practice［J］.Cardiovasc Diabetol，2005，4(1):5.

［8］Kitajima S，Jin Y，Koike T，et al.Lp(a)enhances coronary atherosclerosis in transgenic Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits［J］.Atherosclerosis，2007，193(2):269 －76.

［9］Matsul T，Yamagishi S，Ueda S，et al.Telmisartan，an angiotensinⅡ type 1 receptor blocker，inhibits advanced glycation end-product(AGE)-induced monocyte chemoattractant protein-1 expression in mesangial cells through downregulation of receptor for AGEs via peroxisome proliferator-activated receptor activation［J］.J Int Med Res，2007，35(4):482 －9.

［10］李韬.糖尿病血管内皮损伤机制研究进展［J］.中医药临床杂志，2010，22(3):275 －7.

［10］Li T.The research progress of vascular endothelial injury mechanism of diabetes［J］.Clin J Tradit Chin Med，2010，22(3):275 －7.

［11］常丽萍，张秋燕，韩建科，等.通心络超微粉对缺血性脑卒中大鼠微血管新生影响的实验研究［J］.中国药理学通报，2012，28(7):1015－8.

［11］Chang L P，Zhang Q Y，Han J K，et al.Experimental study on the interventional effects of Tongxinluo supermicropowder on angiogenesis of ischemic stroke rats［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(7):1015－8.

［12］张力，葛才保，黄中伟.2型糖尿病糖耐量试验中血管内皮细胞生长因子动态观察［J］.检验医学，2013，28(7):577 －80.

［12］Zhang L，Ge C B，Huang Z W.The dynamic observation of vascular endothelial growth factor in type 2 diabetes mellitus patients during glucose tolerance test［J］.Laborat Med，2013，28(7):577－80.

［13］祁玥，郑亚宁.血管内皮生长因子的研究进展［J］.青海师范大学学报(自然科学版)，2010，31(4):61 －6.

［13］Qi Y，Zheng Y L.The research progress of vascular endothelial growth factor［J］.J Qinghai Normal Univ(Nat Sci Edit)，2010，31(4):61－6.

［14］Long J，Wang Y，Wang W，et al.Identification of micro RNA-93 as a novel regulator of vascular endothelial growth factor in hyperglycemic conditions［J］.J Biol Chem，2010，285(30):23457 －65.

［15］易茜璐，于明香.糖尿病视网膜病变的发病机制［J］.复旦学报(医学版)，2010，37(5):604 －7.

［15］Yi X L，Yu M X.Pathogenesis of diabetic retinopathy［J］.Fudan Univ J Med Sci，2010，37(5):604 －7.

［16］陈良，蒋锦琪.血管内皮生长因子及其在心血管疾病中的研究进展［J］.中国医师进修杂志，2010，33(16):73 －5.

［16］Chen L，Jiang J Q.Vascular endothelial growth factor and the research progress in cardiovascular disease［J］.Chin J Postgrad Med，2010，33(16):73 －5.

［17］张伟丽，惠汝太.VEGF及其受体在动脉粥样硬化中的作用［J］.中国分子心脏病学杂志，2005，5(3):568 －73.

［17］Zhang W L，Hui N T.The biological role of VEGF and its receptors in atherosclerosis［J］.Mol Cardiol China，2005，5(3):568 －73.

［18］Sun K，Wernstedt Asterholm I，Kusminski C M，et al.Dichotomous effects of VEGF-A on adipose tissue dysfunction［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2012，109(15):5874 －9.

［19］Elshal M F，Kumosani T A，Abulnaja K O，et al.Influence of defatted flaxseed diet on insulinsensitivity，vascular permeability and lipid profile in a rat model of type 2 diabetes mellitus［J］.J Med Plants Res，2012，6(11):2188 －93.