人胆固醇酯水解酶对泡沫细胞的影响及相关机制的研究

关宁，王超，霍晓川，顾立学，罗俊生

（辽宁医学院附属第一医院神经外科，辽宁 锦州 121001）

胆固醇脂水解酶（human cholesteryl ester hydro⁃lase，hCEH）存在于人体的各种组织中（肝脏、心脏、肺脏、小肠、脾脏等），以肝脏中含量最多，主要用于水解胆固醇酯为游离胆固醇，并通过细胞表面通道蛋白将游离释放，减少胆固醇酯在细胞内的蓄积，而ATP结合盒转运蛋白A1（ATP⁃binding cassette transporter A1，ABCA1）和ATP结合盒转运蛋白G1（ATP⁃binding cassette transporter G1，ABCG1）是细胞膜上两种主要的转运蛋白，其中ABCA1能促进胆固醇和磷脂从细胞释放到载脂蛋白A⁃Ⅰ（apolipopro⁃tein A⁃Ⅰ，apoA⁃Ⅰ），而ABCG1可以促进胆固醇外流至细胞外高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）受体［1］，从而借助受体蛋白将肝外游离胆固醇运送回肝脏进行最终的清除。本实验通过先前构建的hCEH重组腺病毒载体［2］，转染RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞，观察hCEH对泡沫细胞的影响及hCEH上调ABCA1和ABCG1表达的相关作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞株购自中国医学科学院基础医学研究所，Lenti⁃hCEH⁃IRES⁃EGFP慢病毒载体由本实验室构建，DMEM培养基购自美国GIBCO公司，氧化型低密度脂蛋（ox⁃LDL）购自北京协生生物科技有限公司，RIPA裂解液、BCA、PMSF蛋白浓度测定试剂盒，内参照β⁃actin购自Santa Cruz公司，ABCA1兔多克隆一抗、ABCG1兔多克隆一抗、羊抗人CEH一抗均购自Abcam公司。

1.2 单核巨噬细胞培养与慢病毒转染

将RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞株置于无菌培养瓶中培养，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中贴壁培养。将处于对数生长期的RAW 264.7细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液接种于24孔培养板中，37℃、5%CO2培养箱培养，待细胞融合度达80%分别加入100 μL目的及对照病毒液，同时加入终浓度为8 μg/mL的佛波酯促进感染。同时设立hCEH组（vector组）作为对照。

1.3 细胞泡沫化

取转染后的细胞进行实验，将细胞密度调整为1×106/mL，加入6孔培养板中培养。加入ox⁃LDL，浓度为100 mg/L，与单核巨噬细胞共同孵育，诱导其泡沫化。

1.4 油红O染色和脂质染色的半定量分析

分别于4 h、8 h、12 h和16 h用10%甲醛将细胞固定细胞，再用油红O方法染色10 min，苏木素染色5 min，1%HC1分色及返蓝后，水洗5 min水性封片剂封片并照相。按Wads［3］方法进行脂质染色的半定量分析，即细胞内脂滴面积＆lt;细胞核面积记为“-”，细胞内脂滴面积≥细胞核面积记为“+”，每孔计数100个细胞。

1.5 高效液相色谱（high performance liquid chro⁃matography，HPLC）法

各组细胞处理结束后去除培养基，PBS液冲洗3遍，反复冻融细胞，并在冰浴中用超声裂解。胆固醇使用外标法峰面积定量细胞蛋白（mg/g）。色谱条件为色谱柱：C18；流动相：异丙醇∶正庚烷∶乙腈（35∶12∶52，v/v），非梯度洗脱，流速为1 mL/min；检测波长为210 nm，检测到第8分钟，柱温保持20℃。用CEH水解胆固醇酯得总胆固醇量，以HPLC测定胆固醇并定量，以“总胆固醇量-游离胆固醇量”代表胆固醇酯的含量（mg/g）。

1.6 Western blot检测CEH、ABCA1、ABCG1蛋白质的表达

经泡沫化处理后，将细胞用细胞刮刀刮下，收集至EP管内。用TBS漂洗后加入RIPA缓冲液（1%NP40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1%SDS，0.1%PMSF）裂解细胞。于4℃离心10 min，弃除沉淀，用BCA法进行蛋白质定量。加热使蛋白质变性，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，丽春红染色观察转移效果，并确定蛋白质分子量标准位置。5%脱脂奶粉封闭过夜，分别加入1∶200稀释的羊抗人CEH一抗、1∶500 ABCA1兔多克隆一抗、1∶2 500 ABCG1兔多克隆一抗，β⁃actin作为内参，4℃培育过夜。TBST洗膜后加入FITC一标记的羊抗兔二抗或辣根过氧化物酶标记的驴抗羊二抗。温育l h，TBST洗膜后进行BCIP/NBT显色，采用Chemi⁃genius凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 hCEH在RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞中的表达

Lenti⁃hCEH⁃IRES⁃EGFP慢病毒转染RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞后，在24 h便可以观察到少量的细胞有荧光表达，48 h后明显增加，72 h接近50%，荧光细胞数最多。我们应用Western blot技术检测慢病毒转染后hCEH mRNA在巨噬细胞的表达，结果可见，hCEH蛋白大量表达，而vector组无条带（图1）。

图1 Western blot分析hCEH蛋白质的表达Fig.1 Protein expression of hCEH by Western blot

2.2 hCEH对细胞胆固醇代谢的影响

油红O染色结果显示：0 h，阳性染色细胞遍布，细胞质红染，细胞核呈蓝染，且细胞体积增大，呈圆形或不规则形；4 h，胞质红染变淡；8 h，油红O染色阳性细胞大量减少，细胞核蓝染，随后阳性细胞越来越少，逐渐消失，见图2。油红O染色0 h、4 h、8 h、12 h、16 h阳性细胞分别为（86.70±3.19）%、（46.50±1.62）%、（15.64±2.57）%、（13.68±2.60）%、（12.73±1.47）%。与4 h比较，8 h、12 h和16 h阳性细胞差异有统计学意义（P＆lt;0.05）；而12 h和16 h比较阳性细胞差异无统计学意义（P＆gt;0.05）。

图2 油红O染色示不同时间段ABCA1和ABCG1表达对巨噬细胞泡沫化的影响 ×400Fig.2 The change of foam cells were detected at 0，4，8，12，16 hour after the formation of foam cell，Oil Red O stain was used to visualize lipid droplets in foam cells×400

HPLC检测结果显示：随着时间增加细胞内胆固醇酯、游离胆固醇和总胆固醇含量逐渐下降，与4 h比较，8 h、12 h、16 h胆固醇酯、游离胆固醇和总胆固醇含量下降，差异均有统计学意义（P＆lt;0.05），而12 h、16 h指标比较差异无统计学意义（P＆gt;0.05），见表2。

表2 高效液相色谱分析不同时间段游离胆固醇、胆固醇酯和总胆固醇含量（mg/g）Tab.2 The cellular free cholesterol，total cholesterol and cholesterol ester by HPLC（mg/g）

2.3 ABCA1和ABCG1对细胞胆固醇代谢的影响

Western blot结果显示：ABCA1和ABCG1表达逐渐增加，8 h达高峰，之后逐渐减少，见图3。

图3 Western blot分析不同时间段ABCA1和ABCG1蛋白质的表达Fig.3 Protein expression of ABCA1 and ABCG1 by Western blot

3 讨论

动脉粥样硬化的防治从宏观角度看，胆固醇逆行转运（reverse cholesterol transport，RCT）过程将肝外游离胆固醇运送回肝脏并最终清除；从微观角度看，细胞表面通道蛋白（如ABCA1和ABCG1）的表达，在不同程度上也促进了RCT的进程。然而，胆固醇稳态的维持是通过许多途径来调节的，清道夫受体CD36和SR⁃A相关联的胆固醇内流起到很重要的作用，但维持这种稳态最重要的途径是胆固醇外流，包括水溶扩散和细胞膜微溶解，内生的载脂蛋白E，细胞外胆固醇受体apoA⁃Ⅰ和HDL，ATP结合盒转运体ABCA1和ABCG1均有效地增加了胆固醇外流［4］。这种胆固醇摄取和排出的平衡一旦打破，泡沫细胞就会在动脉粥样硬化斑块的发生发展中大量产生［5］。

ABCA1和ABCG1都是LXR转录因子的作用靶点，均需要消耗ATP作为能量运输血脂和其他代谢产物。有研究表明，用米非司酮（ABCA1的激动剂）处理转染ABCA1细胞后，胆固醇的流出会显著增加，而没有加入apoA⁃Ⅰ或者未经过米非司酮处理的细胞胆固醇流出无明显增加［6］，说明ABCA1通过apoA⁃Ⅰ发挥作用。OX⁃LDL能使巨噬细胞内胆固醇的流出增多，而HDL是清除过多胆固醇的重要受体。使用3H⁃胆固醇与转染ABCG1的细胞和血浆胆固醇共孵育，发现这一过程中，胆固醇不是流出到apoA⁃Ⅰ，而是流出到HDL上［7，8］，说明ABCG1是通过HDL起作用。

ABCA1和ABCG1在巨噬细胞的RCT过程中起重要的作用。增加巨噬细胞的ABCA1和ABCG1蛋白表达水平后，在粪便和血浆中的胆固醇有明显增加。用药物抑制ABCAl介导的胆固醇流出途径，胆固醇流出量下降了40%；检测敲除ABCG1基因的小鼠，胆固醇流出量比正常下降 15%［9，10］。

本实验成功将hCEH转染入RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞，应用Western blot技术检测到转染Lenti⁃hCEH⁃IRES⁃EGFP后hCEH蛋白在小鼠单核巨噬细胞的表达。泡沫化的hCEH组随着时间增加油红O染色阳性细胞比例逐渐减少，HPLC显示细胞内胆固醇酯、游离胆固醇和总胆固醇含量逐渐下降，在8 h，游离胆固醇含量由4 h的（27.46±1.32）mg/g降至（19.59±2.96）mg/g，胆固醇酯含量由4 h的（31.31±4.26）mg/g降至（9.34±1.35）mg/g，差异有统计学意义（P＆lt;0.05），说明在8 h，胆固醇酯降解、游离胆固醇流出增加。然而，Western blot结果显示：在8 h，AB⁃CA1和ABCG1的表达显著增加，说明ABCA1和ABCG1可以有效减少胆固醇酯在细胞内聚集并加强游离胆固醇的流出，抑制细胞泡沫化。

本实验表明，ABCA1和ABCG1是炎症和RCT之间的分子基础，而hCEH mRNA的表达对这一过程起到了激活作用，不断促进胆固醇外流，抑制动脉粥样硬化的形成，从而减少心脑血管梗死的发生。

［1］Fitzgerald ML，Mujawar Z，Tamehiro N，et al.ABC transporter，ath⁃erosclerosis and inflammation［J］.Atherosclerosis，2010，211（2）：361-370.

［2］关宁，罗俊生，霍晓川，等.hCEH基因慢病毒载体构建及鉴定［J］.军医进修学院学报，2012，33（12）：1303-1305.

［3］Wada Y，Sugiyama A，Yamamoto T，et al.Lipid accumulation in smooth muscle cells under LDL loading is independent of LDL re⁃ceptor pathway and enhanced by hypoxic conditions［J］.Arterio⁃scler Thromb Vasc Biol，2002，22（10）：1712-1719.

［4］Meurs L，Lammers B，Zhao Y，et al.The effect of ABCG1 deficiency on therosclerotic lesion development in LDL receptor knockout mice depends on the stage of atherogenesis［J］.Atherosclerosis，2012，221（1）：41-47.

［5］Williams KJ，Feig JE，Fisher EA.Rapid regression of atherosclero⁃sis：insights from the clinical and experimental literature［J］.Nat Clin Pract Cardiovasc Med，2008，5（2）：91-102.

［6］Vedhachalam C，Liu L，Nickel M，et a1.Influence of ApoA⁃I struc⁃ture on the ABCA1.Mediated efflux of cellular lipids［J］.J Biol Chem，2004，279（48）：49931-49939.

［7］Xu M，Zhou H，Tan KC，et a1.ABCG1 mediated oxidized LDL⁃de⁃rived oxysterol efflux from macrophages［J］.Biochem Biophys Res Commun，2009，390（4）：1349-1354.

［8］Wang N，Lan D，Chen W，et a1.ATP⁃binding cassette transporters G1 and G4 mediate cellular cholesterol efflux to high⁃density lipo⁃pr0teins［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101（26）：9774-9779.

［9］郭赘婧，曹进.ABCA1和ABCG1在胆固醇逆转运中作用的研究进展［J］.国外医学医学地理分册，2012，33（3）：213-217.

［10］Wang X，Collins HL，Ranalletta M，et a1.Macrophage ABCA1 and ABCG1，but not SR⁃BI，promote macrophage reverse cholesterol transport in vivo［J］.J Clin Invest，2007，117（8）：2216-2224.