白介素13基因多态性与哮喘发病易感性的关系

席素雅，陈树珍，刘建强，张 玲，王少颖

(1河北省胸科医院，石家庄050000;2河北省老年病医院)

哮喘是由多种炎症细胞、细胞因子及炎症介质参与的气道慢性非特异性炎症性疾病。目前认为，哮喘是由环境因素和遗传因素共同作用所致的多基因遗传病。近年研究发现，IL-13基因内含子区+1923C/T 多态性与哮喘发病密切相关［1～7］，但其基因多态性分布频率因人群、种族以及生活环境的不同存在一定差异。2011年7月～2013年7月，我们对哮喘患者IL-13基因内含子区+1923C/T单核苷酸多态性进行检测，以期从遗传学角度探讨其发病机制。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 同期选择河北省胸科医院收治的哮喘患者150例(哮喘组)，均符合中华医学会呼吸病学分会哮喘学组2013年制定的《支气管哮喘防治指南》标准［8］。其中男78例、女72例，年龄18～65岁。同期另择该院体检中心健康体检者150例(对照组)，均无哮喘病史，无家庭及个人过敏史。其中男70例、女80例，年龄20～70岁。研究对象均为无血缘关系的北方汉族人，并除外罹患严重急慢性感染、肿瘤、心脏病及肝肾疾病者。两组性别、年龄具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA提取 所有研究对象取外周血3 mL，加入含1.5 mg/mL乙二胺四乙酸二钠的抗凝管中，摇匀，常规酚—氯仿法抽提基因组DNA，-20℃冰箱储存备用。

1.2.2 基因型检测 采用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术扩增基因组DNA。IL-13基因内含子区+1923C/T引物序列参照文献［9］:引物Ⅰ:5'-GGCTGAATATCCATGGTGTGTGTCC-3'，引物Ⅱ:5'-GGCTGAGGTCGGCTAGGCTGAAGAC-3'。25 μL PCR 反应体系:10 × 缓冲液2.5 μL，4 × 脱氧三磷酸核苷(10 mmol/L)2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，10 μmol/L 引物各 1.0 μL，模板 DNA(10 μmol/L)3.0 μL，rTaq DNA 聚合酶(5 U/L)0.25 μL，去离子加至25 μL。扩增反应在热循环仪上完成。循环参数:95℃预变性10 min，94℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35个循环;最后72℃延伸5 min。PCR扩增产物用限制性内切酶BsaAⅠ于37℃水浴消化8 h，然后在3%琼脂糖凝胶上加溴化乙锭(终浓度为0.7 μg/mL)，取8 μL酶切产物在凝胶上上样电泳，紫外线灯照射下观察拍照。

1.2.3 统计学方法 采用 SPSS13.0统计软件。基因型的Hardy-Weinberg平衡符合程度判断采用χ2检验。单个基因型及组间等位基因频率比较采用四格表 χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IL-13基因型分析 IL-13基因内含子区+1923C/T多态性位点PCR扩增产物片段大小为559 bp。PCR产物经限制性内切酶消化后，电泳结果可见3种基因型:TT型(不含酶切位点的纯合子，酶切产物为559 bp)、CC型(含有酶切位点的纯合子，酶切产物为310、249 bp)、CT型(杂合子，产物为559、310、249 bp)。随机选取3种基因型样本的PCR产物进行测序，其结果与PCR-RFLP结果完全一致。酶切结果见图1。

2.2 两组IL-13基因内含子区+1923C/T基因型和等位基因分布频率比较 经Hardy-Weinberg平衡检验，两组基因型符合遗传平衡，具有群体代表性(见表1)。两组IL-13基因内含子区+1923C/T基因型及等位基因频率比较见表2。哮喘组T等位基因(CT+TT基因型)携带者(118例，78.67%)明显高于对照组(88 例，58.67%)(χ2=13.94，P ＜0.01)。

图1 IL-13基因内含子区+1923C/T多态性PCR产物BsaAⅠ酶切电泳结果

表1 两组IL-13基因内含子区+1923C/T基因型分布的Hardy-Weinberg平衡检验(%)

表2 两组IL-13基因内含子区+1923C/T多态性基因型和等位基因频率分布比较［例(%)］

3 讨论

哮喘是一种由多种细胞、细胞因子和炎性介质引起的，以气道高反应性为特征的变态反应性炎症性疾病。细胞因子作为细胞间重要信息传递者，在哮喘的发病过程中起着极为重要的作用。近年来，哮喘的患病率和病死率呈逐年上升趋势，已成为全球范围内严重的公共卫生问题之一［10］。

IL-13在1993年Keystone细胞因子会议上被正式命名［11］，主要是由CD+4Th2细胞分泌的多效性细胞因子，具有多种免疫调节作用。编码人IL-13的基因位于人染色体5q31，全长约4.6 kb，含有4个外显子和3个内含子，分子量约12 kD，是由132个氨基酸组成的非糖基化蛋白。研究表明，IL-13具有促进B细胞分化、提高B细胞活性、减少B细胞凋亡和诱导B细胞合成过多的IgE等从而增加哮喘发生的危险性。Zhu等［12］通过转基因技术发现，IL-13转基因阳性小鼠可出现显著的气道炎症、气道阻塞及气道高反应性现象，提示IL-13可独立参与哮喘的病理生理过程，是哮喘的一个重要的诱发因素。

近年来，随着分子生物学的发展，从基因水平上去认识、诊断和治疗疾病越来越受到人们的重视。多项研究表明，IL-13基因内含子区+1923C/T多态性与支气管哮喘的发生密切相关。2010年华西医科大学呼吸疾病研究所的一项荟萃分析发现，7个基因多态性与哮喘的发病密切相关，其中IL-13+1923C/T、2044A/G基因多态性是中国成人哮喘发病的独立危险因素［13］。侍杏华等［5～7］研究发现，IL-13+1923位点T等位基因可能是哮喘的易感基因。

本研究结果显示，哮喘患者IL-13基因内含子区+1923位点存在C/T突变，且该基因型符合遗传平衡，具有群体代表性。哮喘组TT型和T等位基因频率明显高于对照组，且T等位基因携带者(TT+CT型)在哮喘组明显高于对照组。与CC纯合子相比，TT+CT基因型者哮喘患病风险明显高于对照组，说明T等位基因与哮喘的发病相关。近年认为，IL-13基因内含子区+1923 C/T突变导致IL-13 mRNA的表达增多进而影响血清IL-13及总IgE的水平，进一步导致哮喘的发病。其可能机制［14］为:①当IL-13+1923位点为胞嘧啶时，甲基化DNA可直接干扰转录因子与其结合，阻碍转录进行，而当发生C/T突变时，这种干扰作用消失，转录速度将加快，IL-13 mRNA表达量将增加。②5-甲基胞嘧啶能与特异性甲基化DNA蛋白结合，从而阻断或取代转录因子的作用，转录速度下降;如果5-甲基胞嘧啶脱氨基形成胸腺嘧啶时，则这种阻断作用消失，因而转录速度将加快。③内含子是高等真核生物基因中主要的非编码元件，以往曾被认为无重要功能，但近年研究表明，它在RNA剪切过程中可能有重要作用。RNA剪切过程就是精确去除内含子，而内含子碱基发生位点突变后，可能造成内含子剪切异常，并可能导致基因重组、外显子重复或者外显子再现而提高了特异功能结构域的剂量，从而提高蛋白质的活性或使翻译后剪切产生多个功能单位而引起剂量效应。当然IL-13+1923位点基因多态性对转录及翻译水平影响的确切机制尚未完全明了，这有待国内外专家在基因分子水平上深入研究。

另外，本研究还发现，观察组IL-13基因内含子区+1923位点等位基因 C、T的频率分别为63.33%、36.67%;而196例英国高加索人该位点等位基因频率分别为82.4%、17.6%［15］。这说明不同国家、民族的人群单核苷酸多态性频率分布因不同人群之间的遗传距离以及各族群不同的地理环境和生活方式对基因的选择作用不同而不同，这为人种学及人类迁徙的研究提供更多的科学依据。

综上所述，IL-13基因内含子区+1923C/T多态性在支气管哮喘发病过程中起重要作用，T等位基因可能是促进哮喘发病的一个危险遗传因素。然而，支气管哮喘是一种多因素、多基因遗传性疾病，单一致病基因的影响可能对疾病的发生仅产生微效作用。同时，由于人群的种族、地区差异以及实验条件的局限性，IL-13 T等位基因与支气管哮喘发病的确切关系以及能否作为哮喘发病的分子遗传学标志，还有待大样本的病例对照研究、前瞻性研究以及IL-13基因在细胞内的分子生物学水平研究进一步加以验证。

［1］宋泽庆，吴斌，李文，等.哮喘患者IL-13基因多态性与IL-13、TIgE水平相关性研究［J］.中国免疫学杂志，2005，21(6):469-471.

［2］陈吉庆，孙海平，郭锡熔，等.白细胞介素-13基因多态性对哮喘患儿血清白细胞介素-13及总免疫球蛋白E水平的影响［J］.中国实用儿科杂志，2004，19(4):209-211.

［3］华丽，鲍一笑，吕婕，等.IL-13基因和β2-AR基因单核苷酸多态性与儿童哮喘的关系［J］.临床儿科杂志，2008，26(1):30-32.

［4］孙海平，陈吉庆，郭锡熔，等.IL-13基因多态性与儿童哮喘关系［J］.临床儿科杂志，2003，21(12):786-787.

［5］侍杏华，周建平.IL-13基因和β2-AR基因单核苷酸多态性与哮喘的关系［J］.山东医药，2008，48(32):119-121.

［6］王修海，赵炜，刘世国，等.白细胞介素4和13基因多态性对支气管哮喘患者易感性及血清总IgE水平的影响［J］.中华结核和呼吸杂志，2009，32(3):161-164.

［7］贾春梅，刘雪梅，王冬梅，等.白细胞介素-13基因Intron3+1923多态性与儿童支气管哮喘的关系［J］.中华实用儿科临床杂志，2013，28(9):682-685.

［8］中华医学会呼吸病学分会哮喘学组，中华医学会全科医学分会.中国支气管哮喘防治指南(基层版)［J］.中华结核和呼吸杂志，2013，36(5):331-336.

［9］Graves PE，Kabesch M，Halonen M，et al.A cluster of seven tightly linked polymorphisms in the IL-13 gene is associated with total serum IgE levels in three populations of white children［J］.J Allergy Clin Immunol，2000，105(3):506-513.

［10］黄加忠，李靖，金跃，等.血栓素A2受体基因多态性与哮喘相关性研究［J］.山东医药，2012，52(16):62-63.

［11］Minty A，Chalon P，Derocq JM，et al.Interleukin-13 is a new human lymphokine regulating inflammatory and immune responses［J］.Nature，1993，362(6417):248-250 .

［12］Zhu Z，Homer RJ，Wang Z，et al.Pulmonary expression of interleukin-13 causes inflammation，mucus hypersecretion，subepithelial fibrosis，physiologic abnormalities，and eotaxin production［J］.J Clin Invest，1999，103(6):779-788.

［13］Li X，Zhang Y，Zhang J，et al.Asthma susceptible genes in Chinese population:a meta-analysis［J］.Respir Res，2010，11:129.

［14］R.M.特怀曼著.高级分子生物学要义［M］//陈淳，徐沁等译.北京:科学出版社，2000:86-87.

［15］Pantelidis P，Jones MG，Welsh KI，et al.Identification of four novel interleukin-13 gene polymorphisms［J］.Genes Immune，2000，1(5):341-345.