核桃楸皮化学成分的鉴定及其抗肝癌活性成分筛选

曹治家，蔡小燕，方 薇，陈洪升，张怀念，张咏莉

(广东药学院，广州510006)

核桃楸皮是胡桃科胡桃属落叶乔木核桃楸的干燥树皮，其味微苦、涩，性寒，具有清热燥湿、泻肝明目的功效，主治湿热下痢、目赤肿痛、麦粒肿、迎风流泪、骨结核等。研究证实，核桃楸皮的水提物、乙醚提取物及甲醇提取物等都有抗肿瘤的功效［1～3］。现代药理学研究发现，核桃楸皮含有醌类、黄酮类、萜类、多酚类等多种化学成分［4，5］，但对其所含化学成分的抗肝癌活性研究较少。2012年12月，本课题组鉴定了核桃楸皮的化学成分，并对其进行抗肝癌活性成分筛选。

1 材料与方法

1.1 材料 核桃楸皮，购自黑龙江省伊里嘎山，经鉴定为野生核桃楸树皮(鉴定单位:黑龙江省药材公司);人肝癌细胞株HepG2和人肝组织细胞LO2由中山大学临床药理研究所黄民教授课题组惠赠。RY2型熔点仪，天津分析仪器厂;旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂;层析柱，广州文睿科学仪器有限公司;Bruker DRX600型核磁共振仪，瑞士Bruker公司;LG10-2.4离心机，北京医用离心机厂;Waters510泵-996PDA高效液相色谱仪、Diamonsil C18(5×250 mm)色谱柱，Dikma公司;CO2细胞培养箱，日本SANYO SHEL LAB;酶标仪，美国BIO-RAD。DMEM高糖培养基、胰蛋白酶、胎牛血清，美国Gibco公司;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司;甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等，天津市福晨化学试剂厂;硅胶H(200～300目)、薄层层析硅胶，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂。

1.2 方法

1.2.1 核桃楸皮化学成分的提取、分离及鉴定①乙醇回流提取:取干燥核桃楸皮，粉碎后过20目筛，取粗粉6.0 kg，加入75%乙醇，反复回流提取3次，每次约1.5 h。合并提取液，用旋转蒸发仪浓缩提取液得到260 g浸膏。②分级萃取:将浸膏用5倍量的热水溶解，依次用乙酸乙酯、氯仿萃取，各5次，合并乙酸乙酯、氯仿萃取液，65℃下旋转蒸发仪浓缩蒸馏至干粉状，得到乙酸乙酯、氯仿提取物。③硅胶柱层析:取200～300目硅胶400 g，用氯仿1.5 L浸泡，搅拌除去气泡，湿法装柱，勿使柱内有气泡，充分静置30 min以上。取乙酸乙酯和氯仿提取物20 g加入100 mL甲醇溶解，在研钵中与40 g硅胶研磨均匀，50℃干燥，干法上样。以不同梯度石油醚∶乙酸乙酯(40∶1、30∶1、20∶1、10∶1)流动洗脱，得到各组流份;合并含相同组分的流份，再以不同梯度石油醚∶乙酸乙酯(30∶1、20∶1、10∶1)流动洗脱，得到各组流份。合并含相同组分的流份进行鉴定。④单体成分鉴定:采用制备型高效液相色谱仪，在下列条件下:色谱柱:C18反向色谱柱(XTerra®PrepRP 185 μm 19 ×150 mm);流动相:甲醇∶水(10∶90);流速8 mL/min;检测波长:218 nm;柱温:25℃;采集时间:30 min;进样量:50 μL;全程He气脱气，分离纯化各个单体组分;用核磁共振仪进行1H-NMR、13CNMR分析，以四甲基硅烷为内标，DMSO-D6做溶剂，采用标准脉冲程序进行实验。

1.2.2 体外抗肝癌活性成分筛选［6～8］①细胞培养:在5%CO2、37℃条件下，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人肝组织细胞LO2，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养人肝癌细胞HepG2，2 d传代或换液1次，取对数生长期细胞进行后续实验。②体外抗肝癌活性成分筛选:取对数生长期的HepG2细胞和LO2细胞，调节细胞密度为5×104/mL，接种于96孔培养板，每孔100 μL。培养过夜后，阴性对照组加入100 μL培养基，给药组分别加入终浓度为10、20、40、80、160 μmol/L 的木犀草素及12.5、25、50、100、200 μmol/L 的刺芒柄花素，阳性对照组加入终浓度9.00 μmol/L的5-氟尿嘧啶(5-Fu)，另设调零组(不加细胞及药物)，每组设5个复孔;培养48 h后，弃去含药培养基，每孔加入100 μL无血清培养基及15 μL MTT(5 mg/mL)。在 5%CO2、37 ℃条件下培养4 h后，吸去培养基和MTT，每孔加入150 μL DMSO，在低速摇床上震荡10 min，在酶标仪上490 nm波长处测定各组吸光度(A值)，并计算细胞的存活率及IC50。细胞存活率(%)=(给药组A值-调零组A值)/(阴性对照组A值-调零组A值)×100%，A值为每组各复孔的均值。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件，计量资料以±s表示，组间比较采用Student-t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 核桃楸皮提取物分离及鉴定 核桃楸皮经乙醇回流提取，乙酸乙酯和氯仿萃取，不同梯度石油醚∶乙酸乙酯流动洗脱后，收集到多个色带组分。将各色带组分采用制备型高效液相色谱仪分离纯化，得到其中的2种化合物，经后续的鉴定工作证实为2种黄酮类化合物:木犀草素和刺芒柄花素［9，10］。

2.2 体外抗肝癌活性成分筛选 经48 h处理后，木犀草素对肝癌细胞HepG2的IC50达到(103.32±21.34)μmol/L，对肝组织细胞 LO2 的 IC50达到(131.13 ±13.48)μmol/L;刺芒柄花素对 HepG2 细胞的IC50＞200 μmol/L，说明其对HepG2细胞的毒性作用较小。两种化合物的抗肝癌活性见表1、2。

表1 木犀草素对肝癌细胞HepG2和肝组织细胞LO2存活率的影响(%，±s)

表1 木犀草素对肝癌细胞HepG2和肝组织细胞LO2存活率的影响(%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n 细胞存活率HepG2 LO2对照组5 100.00 ±1.86 100.00 ±1.39阳性对照组 5 53.15±0.58＊＊ 39.31±2.70＊＊给药组10 μmol/L 5 87.94 ±2.62＊＊ 94.08 ±1.11*20 μmol/L 5 71.01 ±6.34＊＊ 86.04 ±1.04＊＊40 μmol/L 5 62.97 ±4.55＊＊ 75.44 ±1.28＊＊80 μmol/L 5 55.23 ±1.73＊＊ 67.98 ±0.66＊＊160 μmol/L 5 43.67 ±1.27＊＊ 40.00 ±2.81＊＊

3 讨论

黄酮类化合物是一种存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物。研究发现，黄酮类化合物具有抗细菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化自由基、抗炎等活性，是目前学者研究的热点。本研究中，从核桃楸皮中分离得到2种黄酮类化合物——木犀草素和刺芒柄花素。黄酮类化合物用水作溶剂提取时，提取物所含杂质较多且不易纯化;用乙醇作溶剂时，提取物中黄酮含量较高。黄酮类化合物是一类热敏性物质，提取分离时温度应控制在65℃以下，否则提取率下降［11，12］。故本研究采用75%乙醇作溶剂回流提取核桃楸皮，并且在旋转浓缩、干燥等环节将温度控制在65℃以下，首次从核桃楸皮中获得了木犀草素和刺芒柄花素2种黄酮类化合物。

表2 刺芒柄花素对肝癌细胞HepG2存活率影响(%，±s)

表2 刺芒柄花素对肝癌细胞HepG2存活率影响(%，±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别 n HepG2细胞存活率对照组100.00 ±1.43给药组12.5 μmol/L 5 96.58 ±0.55 25 μmol/L 5 88.14 ±4.63*50 μmol/L 5 81.27 ±9.01*100 μmol/L 5 82.59 ±3.81*200 μmol/L 5 79.75 ±0.46 5*

近年研究发现，核桃楸皮水煎剂具有明显的抑制肿瘤作用［13］，其提取物核桃醌等可通过诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用［14，15］。本研究结果表明，木犀草素具有较明显的抑制肝癌细胞增殖的作用，且呈一定的剂量—效应关系;对正常肝细胞增殖也有一定的抑制作用;对比木犀草素对肝癌细胞和正常肝细胞的增殖抑制作用可发现，木犀草素对肝癌细胞的增殖抑制作用较大，说明木犀草素对肝癌细胞的毒性作用较正常细胞大。阳性药物5-Fu在相同剂量时对正常肝细胞增殖的抑制作用较对肝癌细胞强，说明5-Fu对正常肝细胞的毒性作用更大，毒副作用更强。比较阳性药物5-Fu与木犀草素对肝癌细胞和正常肝细胞的毒性可发现，木犀草素对2种细胞的毒性均较5-Fu小，且木犀草素对正常肝细胞的毒性小于肝癌细胞。因此认为，与传统抗肿瘤药物5-Fu相比，木犀草素在体外抗肝癌活性具有毒性小、安全性高的优势。同时有文献报道称，木犀草素可以呈剂量和时间依赖性地诱导乳腺癌、肺癌等癌细胞凋亡［16，17］，发挥抗肿瘤作用，说明木犀草素在抗肿瘤方面具有一定的效果，可以作为抗肿瘤候选药物进一步的研究开发。体外抗肝癌活性筛选结果表明，提取物刺芒柄花素对肝癌细胞有一定的增殖抑制作用，且其增殖抑制作用呈一定的剂量—效应关系，但刺芒柄花素对肝癌细胞的增殖抑制作用较木犀草素小，细胞毒性也较木犀草素小。尽管有报道称，刺芒柄花素可抑制胰岛素瘤细胞和乳腺癌细胞生长并诱导其凋亡［18，19］，但关于刺芒柄花素对肝癌细胞的毒性作用情况并没有确切的报道，我们的研究也对此进行了确认和说明。因此，本课题组在下一步的抗肝癌研究中将关注重点集中在木犀草素上。

［1］雷涛，梁启超，常乐，等.核桃楸皮乙醇提取液对人肝癌细胞抑制作用的研究［J］.实验室科学，2012，15(6):81-82.

［2］侯甲福，梁忆红，雷涛，等.核桃楸皮提取物的体外抗肿瘤作用实验研究［J］.牡丹江医学院学报，2011，32(4):15-17.

［3］吴宜艳，梁启超，郑科文，等.核桃楸皮甲醇提取物对人胃癌SGC-7901细胞增殖活性的影响［J］.时珍国医国药，2012，23(10):2598-2600.

［4］蔡小燕，张咏莉.中药材核桃楸皮单体抗肿瘤作用及分子机理研究现状［J］.海峡药学，2013，25(8):13-17.

［5］汪向升，张咏莉.核桃楸的化学成分分析及其抗肿瘤活性概述［J］.热带医学杂志，2013，13(1):122-125.

［6］张慧，裴志东，张修亚，等.乌骨藤脂溶性成分抗肿瘤活性及其成分分析［J］.中国中药杂志，2010，35(24):3325-3328.

［7］韩惠，单淇，周福军，等.箭叶淫羊藿中化学成分及其体外抗肿瘤活性研究［J］.现代药物与临床，2013，28(3):269-273.

［8］吴琪，黄璐，茹梦，等.羊蹄化学成分及其抗肿瘤活性研究［J］.药学与临床研究，2013，21(3):227-229.

［9］任冬梅.两种青兰属植物的化学成分及活性研究［D］.济南:山东大学，2007.

［10］冯雪娇，任虹，曹学丽，等.鸡血藤中黄酮成分的高速逆流色谱分离及其抗肿瘤活性研究［J］.中草药，2011，42(11):2244-2247.

［11］张睿，徐雅琴，时阳.黄酮类化合物提取工艺研究［J］.食品与机械，2003，1:21-22.

［12］成凤桂，欧知义.鄂西藤茶中总黄酮的提取及含量测定［J］.中南民族大学学报(自然科学版)，2005，24(2):19-22.

［13］张咏莉，詹苗，崔玉强，等.山核桃树皮水提物对荷瘤小鼠抑瘤效应及对血象的影响研究［J］.中药材，2009，32(5):770-774.

［14］Xu HL，Yu XF，Qu SC，et al.Juglone，from juglans mandshruica Maxim，inhibits growth and induces apoptosis in human leukemia cell HL-60 through a reactive oxygen species-dependent mechanism［J］.Food Chem Toxicol，2012，50(3-4):590-596.

［15］Yao Y，Zhang YW，Sun LG，et al.Juglanthraquinone C，a novel natural compound derived from Juglans mandshurica Maxim，induces S phase arrest and apoptosis in HepG2 cells［J］.Apoptosis，2012，17(8):832-841.

［16］Kim MJ，Woo JS，Kwon CH，et al.Luteolin induces apoptotic cell death through AIF nuclear translocation mediated by activation of ERK and p38 in human breast cancer cell lines［J］.Cell Biol Int，2012，36(4):339-344.

［17］Park SH，Park HS，Lee JH，et al.Induction of endoplasmic reticulum stress-mediated apoptosis and non-canonical autophagy by luteolin in NCI-H460 lung carcinoma cells［J］.Food Chem Toxicol，2013，56:100-109.

［18］Chen J，Sun L.Formononetin-induced apoptosis by activation of Ras/p38 mitogen-activated protein kinase in estrogen receptor-positive human breast cancer cells［J］.Horm Metab Res，2012，44(13):943-948.

［19］Wang Y，Zhu Y，Gao L，et al.Formononetin attenuates IL-1β-induced apoptosis and NF-κB activation in INS-1 cells［J］.Molecules，2012，17(9):10052-10064.