PI3K/AKt/eNOS信号通路在硫化氢抑制ET-1诱导的心肌肥大中的作用

王雅婧，张学志，刁力，王其新

硫化氢气体（H2S）自被发现具有类似一氧化氮（NO）和一氧化碳的某些生理作用后，在心血管、神经、消化等多个系统受到诸多关注。研究[1]显示内源性H2S发挥舒张血管、调节血压的效应在NO存在的条件下能够明显增强。PI3K上调AKt的磷酸化以激活内皮型-一氧化氮合酶（eNOS），是调控内源性NO合成的最经典途径之一。边云飞等[2]在应用过氧化氢诱导建立心肌细胞氧化应激模型的过程中发现，硫氢化钠预处理能使Akt的磷酸化水平升高，在一定程度上减轻心肌细胞损伤及凋亡，发挥保护作用。也有研究[3]显示在缺血预适应时，H2S可通过上调AKt/eNOS信号通路来改善心肌损伤，ET-1作为肥大刺激因子是研究较多的因子之一，已经证实[4]其最佳有效浓度约为10-9～10-7mol/L。本实验旨在通过ET-1建立心肌肥大模型，探索H2S能否通过上述信号通路抑制ET-1的诱导效应，并寻找可能有效的抑制方法。

1 材料与方法

1.1 动物与主要试剂 清洁级Wistar乳鼠，1～3日龄，由青岛派特福德白鼠养殖专业合作社提供；内皮素-1、5′-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5'-BrdU）由Sigma公司提供；胰蛋白酶、高糖DMEM、青霉素+链霉素、胎牛血清等均购自Hyclone公司；胶原酶Ⅱ型、RIPA细胞裂解液由北京索来宝公司提供；兔抗AKt抗体和兔抗磷酸化AKt抗体购自美国CST公司；总RNA提取试剂盒购自Omiga公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒由碧云天生物技术研究所提供；NO浓度测试盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 肥大心肌细胞模型的建立及细胞分组 胰蛋白酶和胶原酶Ⅱ消化法获取心肌细胞并接种到培养板，滴入5'-BrdU使其终浓度为0.1 mmol/L，培养72 h后将细胞分为对照组、肥大组和实验组进行处理，为了解H2S的有效药物浓度，因此采用不同浓度梯度的NaHS对实验组进一步进行处理，具体如下：①对照组：加入等体积无血清的DMEM培养基；②肥大组：加入终浓度为10-8mol/L 的ET-1；③10-15M NaHS组：加入10-15mol/lNaHS+10-8mol/L ET-1；④10-14M NaHS组：加入10-14mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1；⑤10-13M NaHS组：加入10-13mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1；⑥10-12M NaHS组：加入10-12mol/L NaHS+10-8mol/L ET-1。

1.2.2 心肌细胞表面积的测定 参照文献方法[5]，ET-1和或NaHS持续刺激24 h后用ImageJ图像处理软件测定心肌细胞的表面积，每个孔测5个视野，每个视野测10～15个细胞，取其平均值，作为细胞形态学的指标。

1.2.3 培养液NO含量和各组细胞总蛋白含量的测定 各组实验结束后，获取待测培养液，按照NO含量测定试剂盒说明书操作，酶标仪550 nm比色，测定各组OD值，NO含量（umol/L）= （测定OD值-空白OD值）/（标准OD值-空白OD值）×标准品浓度×稀释倍数；用RIPA细胞裂解液获得细胞蛋白液，根据BCA法测定试剂盒说明书操作，酶标仪562 nm比色，对照标准曲线，测定细胞总蛋白质浓度。

1.2.4 Western Blot法检测AKt蛋白的表达 分别提取各组细胞蛋白30 μg，聚丙烯酰胺变性凝胶分离，湿转法将蛋白转移到PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1.5 h，加一抗（AKt或磷酸化AKt 1:1000稀释，GAPDH 1:3000稀释）4℃过夜孵育，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的二抗（1:6000稀释）室温下孵育1 h。洗膜，ECL显色，凝胶成像仪及Quanlity One软件显影。以GAPDH为内参，计算各组AKt表达的相对量。每组重复3次。

1.2.5 PCR法检测心房钠利尿肽（ANP）、脑钠肽（BNP）、eNOS mRNA的表达 用总RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，A260/A280测定总RNA纯度和浓度，取100 ng遵照逆转录试剂盒说明书合成cDNA。根据NCBI数据库提供的ANP、BNP、PI3K、AKt、eNOS和β-action mRNA基因序列，由上海生工公司合成6对引物。ANP引物序列为：Forward：5'-ACCGAAGATAA CAGCCAAATC-3'，Reverse：5'-GGGTATTCACC ACCTCTCAGTG-3'，PCR反应产物107bP，退火温度61.5℃；BNP引物序列为：Forward：5'-GA GACAAGAGAGAGCAGGACAC -3'，Reverse：5'-GAAAAGCAGGAGCAGAATCATC -3'，PCR反应产物103bP，退火温度63℃；PI3K引物序列为：Forward：5'-AAGCCTCTTCCTCCTCCAAT -3'，Reverse：5'-ACGATGGGTCAAATCCACTT -3'，PCR反应产物374bP，退火温度62℃；AKt引物序列为：Forward：5'-GCCCACACGCTTACTGAGA-3'，Reverse：5'-AGCCCGAAGTCCGTTATCTT-3'，PCR反应产物308bP，退火温度62℃；eNOS引物序列为：Forward：5'-AGGTA TTTGATGCTCGGGACTG -3'，Reverse：5'-AAGATTGCCTCGGTTTGTTG -3'，PCR反应产物97bP，退火温度65℃；β-action引物序列为：Forward：5'-CACCCGCGAGATCAACCTTC-3'，Reverse：5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'，PCR反应产物324bP，退火温度59℃。以cDNA为模板，分别进行ANP、BNP、PI3K、AKt、eNOS和β-action的共同扩增。反应体系为20 ul，扩增条件：94℃，5 min进入循环；94℃，30 s，退火温度30 s，72℃，30 s，循环35次；72℃，7 min。使用PCR仪进行扩增。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳分离。

2 结果

2.1 各组心肌细胞表面积结果 与对照组相比，ET-1组心肌细胞表面积明显增加（P＜0.05)，10-15mol/L-10-12mol/L NaHS可浓度依赖性的降低细胞表面积（F=1078.00，P＜0.01），见表1。

2.2 各组心肌细胞总蛋白含量结果 与对照组相比，ET-1组心肌细胞总蛋白含量明显增加，NaHS可浓度依赖性的抑制各组心肌细胞蛋白合成（F=209.09，P＜0.01）见表1。

2.3 各组培养液NO含量结果 ET-1组较对照组能够明显降低NO含量（P＜0.05），给予NaHS刺激后NO含量随药物浓度的升高而逐渐增加（F=87.69，P＜0.05），10-12mol/L NaHS组可基本恢复至正常水平（P＞0.05），见表1。

2.4 各组ANP、BNP mRNA水平检测结果 ET-1组与对照组比较结果有显著差异（P＜0.05），不同浓度的NaHS能够不同程度的抑制ANP mRNA合成（FANP=27.88，FBNP=12.58，P＜0.05），10-13mol/L、10-12mol/L NaHS组较10-15mol/L、10-14mol/L NaHS组抑制BNP mRNA合成的效应明显（P＜0.05），两组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图1、2。

2.5 各组PI3K、AKt、eNOS mRNA表达结果 ET-1显著降低了PI3K/AKt/eNOS通路三者的mRNA水平（P＜0.05），NaHS能够浓度依赖性的改善表达量（FPI3K=48.63，FAKt=85.88，FeNOS=35.60，P＜0.05），但10-15mol/L组和10-14 mol/L组的PI3K、AKt水平，10-13mol/L组和10-12 mol/L组的eNOS水平无明显差异（P＞0.05），见图3、4、5。

表1 各组心肌细胞表面积、总蛋白含量、培养液NO含量测定结果（±s）

表1 各组心肌细胞表面积、总蛋白含量、培养液NO含量测定结果（±s）

注：与①对照组比较，aP＜0.01；与②肥大组比较，bP＜0.01；各组间比较，P＜0.05

测定指标 ①对照组 ②肥大组（ET-1） ③10-15M NaHS组 ④10-14 M NaHS组 ⑤10-13 M NaHS组 ⑥10-12M NaHS组心肌细胞表面积（n=75），um2/cell 787.27±107.66 1933.80±143.06a 1785.20±73.77ab 1574.00±158.41ab 1194.90±120.60ab 831.87±148.93b心肌细胞总蛋白含量（n=27），ug/ml 218.55±21.28 367.51±25.90 346.49±22.11 319.33±18.78 289.52±17.55 243.31±19.05培养液NO含量（n=9），umol/L 8.63±0.30 4.60±0.73 5.29±0.65 6.41±0.56 7.29±0.38 8.26±0.31a

图1 不同浓度NaHS对ET-1诱导的肥大心肌ANP mRNA表达量的影响

图2 不同浓度NaHS对ET-1诱导的肥大心肌BNP mRNA表达量的影响

图3 不同浓度NaHS对ET-1诱导的肥大心肌PI3K mRNA表达量的影响

图4 不同浓度NaHS对ET-1诱导的肥大心肌AKt mRNA表达量的影响

2.6 各组磷酸化AKt蛋白表达量结果 ET-1组AKt的磷酸化水平低于正常组（P＜0.01)，NaHS能够有效改善这种抑制效应，恢复AKt的磷酸化水平（F=36.10，P＜0.01)，但仍低于正常水平（P＜0.05），且10-13mol/L、10-12mol/L NaHS的作用差异不显著（P＞0.05）见图6。

图5 不同浓度NaHS对ET-1诱导的肥大心肌eNOS mRNA表达量的影响

图6 不同浓度NaHS对ET-1诱导的肥大心肌磷酸化AKt表达量的影响

3 讨论

既往研究[6]提示ET-1能够在纳摩尔水平通过多种调控方式包括L型钙通道、钙激活氯通道、蛋白激酶C和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路等增加细胞蛋白质合成，诱导心肌细胞肥大，有效建立心肌肥厚模型。早期高血压机制研究已经证实ET-1内源性的生成与NO存在动态平衡，两者相互拮抗维持正常心血管的生理作用[7]。在心血管系统中NO主要由内皮型NOS（eNOS）催化底物左旋精氨酸合成，心肌细胞本身可于细胞膜和横管之间的小窝处合成eNOS，后者与小窝受体通过caveolin-3形成eNOS-caveolin-3-小窝受体复合物[8]。包括内皮素受体、缓激肽β2受体、β3-肾上腺素能受体等多种受体便可以与eNOS在小窝处共定位，发挥相应的生物作用[9-11]。与野生型小鼠的离体心肌细胞相比，eNOS基因敲除的小鼠离体心肌细胞对心肌肥大诱导药物的敏感性升高出现过度增殖反应[12]。在本实验中，外源性给予ET-1诱导处理后，eNOS mRNA的表达量及培养液NO含量较对照组减少，ET-1/NO平衡被打破，同时心肌细胞表面积及蛋白含量、ANP及BNP mRNA水平均明显增加，证实了通过破坏该平衡能够建立较完善的实验模型。

本实验结果显示，在ET-1诱导的心肌细胞肥大下，PI3K、AKt、eNOS mRNA的表达均被明显抑制，AKt蛋白下调，培养液中NO的释放也减少，这些结果提示PI3K-AKt-eNOS信号途径受损在ET-1诱导心肌肥大过程中有重要意义。在应用NaHS处理肥大的心肌细胞后，磷酸化AKt表达上调，PI3K、AKt、 eNOS mRNA的表达量及培养液NO含量均较肥大组明显增加，提示该药物可能通过PI3K-AKt-eNOS信号途径改善NO的合成，抑制ET-1的生成水平。在上述指标中，NO含量的变化与信号通路的变化不完全相同，尤其以10-12mol/L NaHS组为著，提示在该信号通路控制NO生成的过程中可能存在其他因子的正向调节，促进上游AKt、eNOS的活性表达。

虽然给予较低浓度的NaHS（10-15-10-14mol/L）后，两组eNOS与NO水平差异有统计学意义，但在PI3K及AKt水平变化并不显著。PI3K具有丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）激酶活性，在被G蛋白偶联受体、蛋白酪氨酸激酶受体和Ras蛋白活化后产生第二信使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate，PIP3），它能与AKt氨基末端的PH结构域结合，使AKt发生构象改变并暴露Thr308和Ser473磷酸化位点，进一步激活下游底物形成较完整独立的信号通路。既往也有研究[13]显示，ET-1作为属于G蛋白偶联家族受体配体，可激活PI3K/AKt信号通路，灭活GSK3β，抑制其参与的负向调节心肌细胞肥大的过程[14]。两种截然相反的实验结果提示在ET-1诱导心肌肥大的过程中，虽存在PI3K/AKt/eNOS信号通路的受损，但少量存留的磷酸化PI3K、AKt仍可以激活其他通路的下游底物促进ET-1的肥大效应，二者可能同时具有相反的生物效应，H2S是否也能通过调节其他信号通路抑制心肌肥大尚需进一步的实验证实。

综上所述，H2S可能通过PI3K/AKt/eNOS信号通路抑制ET-1诱导的心肌肥大，但在激活PI3K/AKt通路后除eNOS外有无调控其他下游效应分子发挥作用需要进一步探讨。

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