水杨酸对人肝癌HepG2细胞体外生长的影响的研究*

林 冰，郎锦义，雷 晴

(1．成都中医药大学附属医院，成都 610072;2．四川省肿瘤医院，成都 610041)

水杨酸(salicylic acid，SA)是从植物白柳回(white willow back)和冬青叶(wintergreen leaves)中所获得的物质。作为一种重要的植物激素，SA具有十分重要的药理作用［1］。乙酰水杨酸(Acetylsalicylic acid，ASA)的抗炎作用是由SA产生的，目前已广泛应用于临床。有研究表明，在服用阿司匹林的人群中，SA可以减少1/4患结直肠癌的风险和1/3因该病致死的风险，几十年后死于包括胃癌、食道癌及肺癌在内的实体肿瘤的可能性要降低21%［2］。作为一种抗炎药物，SA和ASA具有抗肿瘤的特性。不断增加的证据显示［3-8］，SA具有诱导或促进多种肿瘤细胞凋亡的作用，包括结直肠癌、嗜铬细胞瘤，乳腺癌，黑色素瘤和白血病等。最近有报道［9，10］，除SA衍生物法尼基硫代水杨酸(Farnesylthiosalicylic acid)可诱导胶质母细胞瘤和肝癌细胞的凋亡和生长抑制外，但SA直接作用于人肝癌细胞诱导其凋亡和生长抑制作用尚未见报道。因此，本文对SA是否抑制人肝癌HepG2细胞的生长和潜在机制进行了初步研究和探讨。

1 材料与方法

1．1 药品与试剂

水杨酸 (Salicylic Acid，含量99．5%HPLC)，购自成都麦德森生物科技公司;MTT、二甲基亚砜(DMSO)和碘化丙啶(PI)，购自美国Sigma公司;EdU试剂盒购自广州锐博生物科技公司。

1．2 细胞株及细胞培养

人肝癌细胞株HepG2(美国ADCC)常规培养于含10%胎牛血清(FCS)RPMI-1640(Gibco)培养基(全培基)中，于37℃、5%CO2条件下传代培养，取指数生长期细胞进行以下实验。

1．3 MTT法测定细胞存活

将呈指数生长的HepG2细胞用0．25%胰酶消化液消化，并用10%FCS RPMI-1640培养基制成5×105细胞/ml的单细胞悬液，从中取100μl接种于96孔培养板中;将热溶于无血清RPMI-1640培养基的SA浓缩液，用全培基分别稀释成终浓度的2×液，分别取100μl加入上述96孔培养板中，至终浓度分别为 2．5mmol/L、5．0 mmol/L、7．5 mmol/L 和10 mmol/L;对照孔和空白孔加入100μl全培基，每个浓度组设6个复孔，置于 CO2培养箱中培养48hrH后，除空白孔外，所有孔加入20μl 5mg/ml MTT，37℃反应 4hr后，弃上清，加入 150μl DMSO，振荡溶解后，用酶标仪(Bio-Rad)于570nm波长测定吸光度A值，并下式计算细胞存活率，拟合药物浓度-细胞存活率曲线，用获得的函数式计算半数抑制浓度IC50值。

1．4 EdU检测细胞增殖活性

按EdU试剂盒说明书叙述的实验程序进行。取指数生长期HepG2细胞，以每孔1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段，用7．5mmol/L SA处理24hr。用全培基按1000∶1的比例稀释EdU溶液，制备成50μmol/L的EdU反应液;每孔加入100μl孵育2小时，弃培养基;每孔加入4%多聚甲醛-PBS 50μl，室温固定30分钟;每孔加入1 × A-pollo®染色反应液100μl，避光室温脱色30分钟后，弃染色反应液;用1×Hoechst33342进行DNA染色，于倒置荧光显微镜(Olympus)下观察并采图。

1．5 FCM检测细胞周期和凋亡

［4］的方法。收集指数生长期HepG2细胞，消化制成单细胞悬液，取5×105细胞接种于6孔板中，24hr后加入SA溶液至终浓度为7．5mmol/L，2×105细胞接种于对照孔，培养 48hr后，消化收集细胞，PBS离心洗涤1次，冰预冷的70%乙醇固定1hr，离心，弃乙醇，用PBS离心洗涤1次，弃上清;加入反应Buffer制成单细胞悬液，再加入PI，避光反应30分钟后，上流式细胞仪(FCM，Becton Dickinson)进行检测和分析。

1．6 统计分析

应用SPSS13．0软件进行数据分析，采用单因素方差分析，以P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 SA对HepG2细胞存活的影响

MTT法测定结果显示，不同浓度SA作用于HepG2细胞48hr，其存活率呈浓度依赖的降低，分别为 69．2% ± 3．2%、59．2% ± 2．96%、50．8% ±2．50%、45．8% ±2．29%，其 IC50值为 8．92 mmol/L±0．45 mmol/L(见图1)，表明SA对HepG2细胞具有明显的生长抑制作用。

图1 SA对HepG2细胞存活率的影响

2．2 SA对HepG2细胞增殖活性的影响

SA降低了DNA合成时EdU的掺入，导致SA处理的HepG2细胞的红色荧光强度及其细胞数(图2-A)显著小于对照细胞(图2-B)，表明SA通过抑制HepG2细胞的DNA合成和复制，降低HepG2细胞的增殖活性。

2．3 SA对HepG2细胞周期和凋亡的影响

FCM结果显示，SA持续作用24hr后，HepG2细胞周期G0/G1比例较对照细胞增加了31．2%，表明SA能够显著诱导HepG2细胞周期G0/G1阻滞(表1);同时，SA作用于HepG2细胞后，出现明显的凋亡峰，与对照组细胞凋亡率2．3% ±0．11%比较，其凋亡率24．9% ±0．32%显著增加(图3)，P＜0．05，表明SA可诱导HepG2细胞凋亡。

图2 SA显著抑制HepG2细胞的增殖活性(×200);蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表增殖活性较强的细胞。

表1 SA对HepG2细胞周期的影响

图3 SA诱导HepG2细胞凋亡

3 讨论

肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率都位居世界前列，且呈逐年上升趋势。由于肝癌的发生机制仍未明确，恶性程度极高，导致临床治疗的预后极差和生存期短。HBV感染引起肝组织的慢性炎症作用导致肝细胞的正常基因表达如癌基因和抑癌基因突变，以及干扰了细胞信号转导，促进其恶性转化和肿瘤发生。靶向肝癌发生相关基因表达及其信号转导通路，阻断或抑制介导肝癌细胞增殖和抗凋亡的靶标分子是当前诱导或促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长的主要药物干预策略。

植物激素(phytohormone)是植物体内存在的一类天然的生理活性物质，调节控制着植物生活周期的各个方面，包括植物肿瘤。植物肿瘤的生物学特征在很多方面与哺乳动物肿瘤具有相似性。SA是一种小分子酚类植物激素，在包括植物免疫响应的多种生理过程中发挥一个重要的调节作用。作为植物免疫调变剂，SA介导的防御信号网络研究取得了显著进展［11］。

最近Hawley在《SCIENCE》报道了对SA研究的重大发现［12］，SA是阿司匹林的一种天然成分，可直接激活与肿瘤抑制相关的一条信号通路，即直接作用并活化5’-磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)信号通路。AMPK 是细胞过程的一个关键调控因子，在细胞代谢中起着关键作用，其参与了细胞增殖，细胞凋亡和细胞周期及其生长的调节作用，是一种抗生长分子，尤其在肝脏中发挥着更大的作用［13］。研究证实［14］，AMPK活化通过上调p53p21轴介导的上调细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs)引起 G1细胞周期阻滞和通过抑制mTOR信号通路介导的细胞生长和增殖必需的蛋白质合成，从而抑制细胞的增殖。假设AMPK活化丢失促进肿瘤的发展，相反，药理激活AMPK最近已被证明对许多人类肿瘤细胞株，人类肿瘤异种移植和小鼠肝癌移植瘤具有细胞毒作用［15］。我们的结果显示，SA可阻止HepG2细胞由G1期向S期移行，导致G1期阻滞，抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡，提示这可能与SA活化AMPK介导的细胞增殖的负性调节作用有关。

综上所述，SA在体外能够抑制肝癌细胞的生长。AMPK作为一个靶标分子，SA(一种我们接触了几千年的天然化合物)可直接激活AMPK，有可能为肝癌的潜在治疗作用提供新的途径。

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