海洋污损细菌群落结构及其发酵液中化学成分的研究

于 洋 , 王建华 , 方圣涛 姜作真, 周晓群, 夏传海

(1. 中国科学院 烟台海岸带研究所 海岸带生物学与生物资源利用所重点实验室 山东 烟台 264003; 2. 烟台水产研究所, 山东 烟台 264000; 3. 中国科学院 海洋环境腐蚀与生物污损重点实验室, 山东 青岛266071; 4. 中国科学院大学, 北京 100049)

海洋生物污损是指包括海洋动物(如紫贻贝、藤壶等), 海洋植物(如石莼等), 以及海洋微生物(如细菌、硅藻等)在浸水人工设施表面的附着、生长和繁殖[1]。生物污损的形成过程分为如下几个步骤: 首先是有机颗粒在浸水设施表面上附着形成条件膜; 然后是污损细菌和硅藻等微型污损生物的黏附, 在条件膜表面形成生物膜; 随后其他污损生物如藻类孢子及大型污损动物的幼虫进一步在生物膜的表面进行黏附并发育生长, 形成复杂的大型生物污损层,这给海水养殖业、海上运输业、海上采油等带来了巨大的经济损失[2]。近年来, 随着人类海事活动的增加, 生物污损的形成机制及其新型的防除方法探索逐渐成为海洋领域的研究热点。

生物污损可以分为微型污损和大型污损, 微型污损是指污损细菌及硅藻等形成的污损生物膜, 改变了设施表面润湿度、微观形貌等物理化学特征, 影响着大型污损过程, 即大型藻类和污损动物的进一步附着和生长[3]。污损生物膜的形成是大型污损层形成的基础, 为后续污损的发生提供了立足点, 因此,污损生物膜被认为是揭示生物污损形成机制和研究开发新型防污剂的重要突破点。

污损生物膜是由污损细菌、硅藻及其分泌的胞外聚合物组成, 鞭毛虫、纤毛虫等占不到 1%, 具有完整、复杂的三维结构[4]。在海洋环境中, 细菌构成了生物膜的主要组成部分, 研究表明, 污损生物膜细菌群落结构及其次级代谢产物能够影响后续污损的形成[5]。例如, 王冲等[6]研究发现, 细菌生物膜可以促进厚壳贻贝幼虫的附着和发育, 促进作用随生物膜干重、细菌密度等的增加而增强。对藤壶幼虫的附着现象研究表明, 不同菌落组成的生物膜样品均可以促进藤壶幼虫的附着, 但幼虫倾向于附着于潮间带生物膜上, 表明生物膜菌落组成存在时空差异, 而不同细菌组成的生物膜对藤壶孢子的附着存在一定影响[7]。Campbell等[8]研究了细菌群落组成与巨蛎幼虫附着的关系, 发现细菌生物膜可以促进幼虫附着, 促进作用随生物膜生物量的增加而增强,而且幼虫附着率与细菌生物膜群落组成相关。Dahms等[9]制备了菌落组成不同、活性不同、细菌密度不同的生物膜, 并用以研究华美盘管虫幼虫附着, 发现附着率存在明显差异。二者均提出污损细菌群落差异造成的对后续污损效应的不同, 可能是由细菌代谢物引起。Harder等[10]对生物膜细菌发酵上清液的研究证实, 污损细菌产生的某些物质能够促进华美盘管虫的附着生长。因此, 研究污损细菌群落结构及其代谢物, 是探究生物污损形成机制和开发新型抗污剂的重要方向。

本文是针对污损细菌组成的污损微生物膜展开研究工作的, 对烟台海域实地挂板取得的微生物膜细菌群落结构进行了分析, 并对其发酵液中的化学成分进行了分离纯化与结构鉴定, 从中发现了多种DKP类化合物及其他种类的代谢物, 为探究污损生物膜的形成和作用机制奠定了物质基础。

1 材料与方法

1.1 菌种来源及其培养

污损微生物膜为2011年11月烟台海域海上挂板实验所得, 取样地点为 37°30′48.45′ N, 121°26′41.37′ E,挂板时间为 6 d, 所用板材为聚氯乙烯(poly vinyl chloride, PVC)板。

发酵培养: 用棉签将板材表面微生物膜刮至液体培养基中备用。取适量菌体接种于灭菌后的培养基中, 30 ℃, 120 r/min 摇床培养12 h。选用营养琼脂培养基培养细菌[11], 培养基均为海水配制, 121℃灭菌20 min后使用。共发酵20 L。

1.2 菌种鉴定

采用 CTAB-SDS法提取污损微生物膜细菌总DNA[12]。经过454 Roche GS-FLX高通量测序确定微生物膜样品中的细菌种类[13]。

1.3 代谢产物的分离纯化

发酵液5 000 r/min离心10 min, 取上清液, 分别用乙酸乙酯和正丁醇萃取4次, 减压浓缩至干, 得到粗提物[14]。粗提物经硅胶柱层析分离, 以二氯甲烷/甲醇不同比例混合液为洗脱剂, 按照30∶1 (600 mL)、20∶1 (400 mL)、10∶1 (400 mL)、5∶1 (400 mL)梯度进行洗脱, 得到 8个组分。其中组分 A经反复硅胶柱层析, 以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱得到化合物(9)(122 mg)。组分B经反复硅胶柱层析, 以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱得到化合物(8) (22 mg)。组分C经反复硅胶柱层析, 以石油醚/丙酮梯度洗脱得到化合物(1)(17 mg), 化合物(2) (16 mg); 剩余部分经二氯甲烷/甲醇梯度洗脱得到化合物(7)(3 mg)。组分D经反复硅胶柱层析, 以石油醚/丙酮梯度洗脱得到化合物(4) (127 mg)。组分E经反复硅胶柱层析及反相硅胶柱层析得到化合物(3)(98 mg); 剩余部分经二氯甲烷/甲醇=1∶1凝胶柱层析得到化合物(6)(8 mg)。组分 F经反复硅胶柱层析, 以二氯甲烷/甲醇梯度洗脱得到化合物(5)(200 mg)。

1.4 结构鉴定

仪器: Bruker AVANCE III 500型超导核磁共振波谱仪(瑞士 Bruker公司)。将所得化合物溶解于氘代试剂中, 进行核磁共振扫描(1H NMR为 500MHz,13C NMR为125MHz)。记录1H NMR、13C NMR、DEPT90、DEPT135等谱图信息。

2 结构与分析

2.1 污损微生物膜细菌组成

高通量测序结果表明, 该批微生物膜样品中共含有如下几种细菌: 假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.), 芽孢杆菌(Bacillus sp.), 盐单胞菌(Halomonas sp.), 嗜冷杆菌(Psychrobacter sp.), 肠杆菌(Enterobacter sp.)。从芽孢杆菌属共鉴定得到海水芽孢杆菌(Bacillus aquimaris), 抱川芽孢杆菌(Bacillus pocheeonensis), 产氮芽孢杆菌(Bacillus azotoformans), 越南芽孢杆菌(Bacillus vietnamensis)。从假交替单胞菌属共鉴定得到依氏假交替单胞菌(Pseudoalteromonas issachenkonii), 河豚毒素假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas tetraodonis), 别样假交替单胞菌(Pseudoalteromonas aliena), 普里兹湾假交替单胞菌(Pseudoalteromonas prydzensis), 海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)。测序结果中芽孢杆菌占 67.9%, 假交替单胞菌占20.8%, 是生物膜中的优势菌。

2.2 次级代谢产物结构鉴定

化合物(1): C7H10N2O2, 白色固体。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 6.59 (1H, s, NH-8), 4.09 (1H, m,H-6), 3.92 (2H, m, H-9), 3.59 (2H, m, H-3), 2.40 (2H,m, H-5), 1.94 (2H, m, H-4).13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 169.7 (C-1, C=O), 163.4 (C-2, C=O), 58.5(C-6), 46.6 (C-9), 45.3 (C-3), 28.4 (C-5), 22.4 (C-4)。核磁数据经与文献对照[15], 基本一致, 化合物(1)被鉴定为环(脯氨酸-甘氨酸)。

化合物(2): C8H12N2O2, 淡黄色固体。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 6.63 (1H, s, NH-8), 4.22 (1H, m,H-6), 4.06 (1H, m, H-9), 3.45 (2H, m, H-3), 2.79 (2H,m, H-5), 1.94 (2H, m, H-4), 1.49 (3H, d, J = 6.8 Hz,H-10)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 169.6 (C-1,C=O), 165.2 (C-7, C=O), 59.1 (C-6), 56.3 (C-9), 45.3(C-3), 28.1 (C-5), 22.7 (C-4), 15.9 (C-10)。核磁数据经与文献对照[16], 基本一致, 化合物(2)被鉴定为环(脯氨酸-丙氨酸)。

化合物(3): C11H18N2O3, 淡黄色油状液体。1H NMR (CDCl3, 500 MHz) δH: 6.10 (1H, s, NH-8), 4.51(1H, m, H-6), 4.08 (1H, m, H-9), 3.71 (1H, m, H-4),3.57 (2H, m, H-3), 2.40 (2H, m, H-5), 1.79 (2H, m,H-10), 1.52 (1H, m, H-11), 1.01～1.02 (6H, m, H-12,13)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 170.4 (C-1,C=O), 166.2 (C-7, C=O), 68.5 (C-4), 57.4 (C-6), 54.3(C-3), 53.4 (C-9), 38.5 (C-5), 37.4 (C-10), 24.7 (C-11),23.2 (C-12), 21.2 (C-13)。核磁数据经与文献对照[17],基本一致, 化合物(3)被鉴定为环(4-羟基-脯氨酸-亮氨酸)。

化合物(4): C14H16N2O3, 淡黄色固体。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 7.06 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2′,6′), 6.81 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3′, 5′), 6.63 (1H, s,NH-8), 4.12 (1H, m, H-6), 4.09 (1H, m, H-9), 3.56 (2H,m, H-3), 3.45 (2H, m, H-10), 2.35 (2H, m, H-5), 1.92(2H, m, H-4)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 170.5(C-1, C=O), 166.4 (C-7, C=O), 155.9 (C-4′), 130.3(C-3′, 5′), 126.8 (C-1′), 116.0 (C-2′, 6′), 59.1 (C-6),51.2 (C-9), 45.4 (C-3), 36.0 (C-10), 28.3 (C-5), 22.4(C-4)。核磁数据经与文献对照[18], 基本一致, 化合物(4)被鉴定为环(脯氨酸-酪氨酸)。

化合物(5): C4H4N2O2, 白色固体。1H NMR(DMSO-d6,500MHz) δH: 11.00 (1H, s, NH-1), 10.81(1H, s, NH-3), 7.39 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6), 5.44 (1H,d, J = 7.6 Hz, H-5)。13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δC:164.7 (C-14, C=O), 151.9 (C-7, C=O), 142.6 (C-5),110.6(C-6). 核磁数据经与文献对照[19], 基本一致,化合物(5)被鉴定为尿嘧啶。

化合物(6): C5H6N2O2, 白色固体。1H NMR(DMSO-d6,500MHz) δH: 10.97 (1H, s, NH-1), 10.58(1H, s, NH-3), 7.24 (1H, s, H-6), 1.76 (3H, s, H-7)。13C NMR (DMSO-d6, 125 MHz) δC: 165.3 (C-4, C=O),151.9 (C-2, C=O), 138.1 (C-6), 108.1 (C-5), 12.2(C-7)。核磁数据经与文献对照[20], 基本一致, 化合物(6)被鉴定为胸腺嘧啶。

化合物(7): C8H10O2, 白色固体。1H NMR (CDCl3,500 MHz) δH: 7.11 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2, 6), 6.81(2H,d, J = 8.5 Hz, H-3, 5), 3.83 (2H, t, J = 6.6 Hz, H-8),2.81 (2H, t, J = 6.5 Hz, H-7)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 154.2 (C-4), 130.5 (C-1), 130.1 (C-2), 115.4(C-3), 63.8 (C-7), 38.2 (C-8)。核磁数据经与文献对照[21],基本一致, 化合物(7)被鉴定为对羟基苯乙醇。

化合物(8): C5H30O2, 淡黄色油状。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 2.36 (2H, t, J = 7.5 Hz, H-2),1.65 (2H, m, H-3), 1.22～1.42 (22H, m, H-4～14), 0.90(3H, m, H-15)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 179.80(C=O), 34.21 (C-2), 32.15 (C-3), 29.89 (C-4), 29.69(C-5), 29.66 (C-6), 29.62 (C-7), 29.58 (C-8), 29.46(C-9), 29.36 (C-10), 29.29 (C-11), 29.21 (C-12), 24.9(C-13), 22.9 (C-14), 14.2 (C-15)。核磁数据经与文献对照[22], 基本一致, 化合物(8)被鉴定为十五烷酸。

化合物(9): C24H38O4, 无色透明油状。1H NMR(CDCl3, 500 MHz) δH: 7.72 (2H, m, H-2, 5), 7.53 (2H,m, H-3, 4), 4.24 (4H, m, H-1′, 1″), 1.72 (2H, m, H-2′,2″), 1.27～1.51 (16H, m, H-3′, 4′, 5′, 7′, 3″, 4″, 5″, 7″),0.96 (6H, m, H-6′, 6″), 0.94 (6H, m, H-8′, 8″)。13C NMR (CDCl3, 125 MHz) δC: 167.9 (2 x C=O), 132.6(C-1, 6), 131.0 (C-3, 4), 129.0 (C-2, 5), 68.3 (C-1′, 1″),38.9 (C-2′, 2″), 30.5 (C-3′, 3″), 29.1 (C-4′, 4″), 23.9(C-7′, 7″), 23.1 (C-5′, 5″), 14.2 (C-6′, 6″), 11.1 (C-8′,8″)。核磁数据经与文献对照[23], 基本一致, 化合物(9)被鉴定邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯。文献报道该化合物为常见塑化剂, 可能为实验过程中塑料制品带来的杂质, 虽然有报道称其为微生物次级代谢产物,但其真实来源有待于进一步考证。

化合物(1) ～ (9)结构式如图1所示。

3 结果与讨论

生物污损给人类海事活动带来了许多困扰, 有效环保地防御生物污损是人类面临的巨大挑战。探究污损微生物膜细菌的次级代谢产物, 是生物污损发生发展机制的基础性研究, 有利于揭示污损微生物膜的作用机制, 从而为生物污损的防除奠定理论及物质基础。信号分子作为污损生物膜细菌的一类次级代谢产物, 同时是微生物群体感应的媒介, 在调控生物膜形成过程起着重要的作用[24]。其中DKP是一类环二肽衍生物, 研究表明一些 DKP可以影响生物膜的形成, 并且对某些细菌的群体感应系统具有猝灭作用。例如 DKP在 Pseudomonas aeruginosa中能够诱导群体感应发生, 进而影响该菌生物膜的形成; DKP能有效抑制Streptococcus liquefyaciens的群体感应系统的运行[25]。Li等[26]研究发现从海洋细菌Streptomyces fungicidicus中分离得到的DKP能显著抑制藤壶的附着, 具有良好的防污性能,表明这类物质也有可能作为防污剂来进行开发和使用。

图1 化合物(1)～(9)结构式Fig 1 Structures of chemicals (1)～(9)

本研究以污损微生物膜细菌为研究对象, 对烟台海域污损微生物膜细菌组成进行了调查研究, 并从污损微生物膜细菌发酵液中分离得到了 9种细菌次级代谢产物, 其中化合物(1)～(4)为 DKP类信号分子, 作为微生物产生的常见信号分子, 其在细菌群体感应中可能起到调控作用; 化合物(5)和化合物(6)为DNA的主要构成部分之一, 含氮碱基在生物遗传信息的合成过程中起到重要作用, 这些化合物在微生物膜的形成和发展过程中的作用机制及其信号物作用有待于进一步考证。微生物膜作为浸水设施表面最初的附着生物群体, 影响着后续污损的形成,因此, 了解微生物膜的发生和发展过程是选择新型防污剂和防污技术的重要环节。通过在实验室培养条件下对污损微生物膜细菌代谢物进行分离纯化与结构鉴定, 本研究发现污损微生物膜细菌可以产生DKP类信号分子, 为探究信号分子在污损微生物膜形成中的作用提供了理论依据, 并为生物污损形成机制研究和新型抗污剂的开发奠定了物质基础。

[1] Callow M E, Callow J A. Marine biofouling: a sticky problem [J]. Biologist, 2002, 49(1): 1-5.

[2] Yebra D M, Kiil S, Johansen K D. Antifouling technology—past, present and future steps towards efficient and environmentally friendly antifouling coatings [J]. Prog Org Coat, 2004, 50(2): 75-104.

[3] Qian P Y, Lau S C K, Dahms H U, et al. Marine biofilms as mediators of colonization by marine macroorganisms: implications for antifouling and aquaculture [J]. Mar Biotechnol, 2007, 9(4): 399-410.

[4] Dobretsov S, Thomason J C. The development of marine biofilms on two commercial non-biocidal coatings: a comparison between silicone and fluoropolymer technologies[J]. Biofouling, 2011, 27(8): 869-880.

[5] Salta M, Wharton J A, Blache Y, et al. Marine biofilms on artificial surfaces: structure and dynamics [J].Environ Microbiol, 2013, 15(11): 2879-2893.

[6] Wang C, Bao W Y, Gu Z Q, et al. Larval settlement and metamorphosis of the mussel Mytilus coruscus in response to natural biofilms [J]. Biofouling, 2012,28(3): 249-256.

[7] Qian P Y, Thiyagarajan V, Lau S C K, et al. Relationship between bacterial community profile in biofilm and attachment of the acorn barnacle Balanus Amphitrite [J]. Aquat Microb Ecol, 2003, 33(3):225-237.

[8] Campbell A H, Meritt D W, Franklin R B, et al. Effects of age and composition of field-produced biofilms on oyster larval setting [J]. Biofouling, 2011, 27(3):255-265.

[9] Dahms H, Qian P Y. Exposure of biofilms to meiofaunal copepods affects the larval settlement of Hydroides elegans (Polychaeta) [J]. Mar Ecol Prog Ser,2005, 297: 203-214.

[10] Harder T, Lau S C K, Dahms H U, et al. Isolation of bacterial metabolites as natural inducers for larval settlement in the marine polychaete Hydroides elegans[J]. J Chem Ecol, 2002, 28(10): 2029-2043.

[11] Liu S, Lu Y J, Lu Z X, et al. Antibacterial activity and property of the fermentation product of marine Streptomyces sp. GB-2 [J]. Chin J Biotech, 2007, 23(6):1077-1081.

[12] 刘小勇, 田素忠, 秦国夫, 等. 植物和微生物DNA的SDS-CTAB改进法[J]. 北京林业大学学报, 1997,19(3): 100-103.

[13] 孙志宏, 刘文俊, 张和平. 基于宏基因组方法对西藏传统发酵牦牛奶中微生物多样性的研究[J]. 北京工商大学学报(自然科学版), 2012, 30(4): 19-24.

[14] Chellaram C, Anand T P, Shanthini C F, et al. Bioactive peptides from epibiotic Pseudoalteromonas strain P1[J]. APCBEE Procedia, 2012, 2: 37-42.

[15] Chen J H, Lan X P, Liu Y H, et al. The effects of diketopiperazines from Callyspongia sp. on release of cytokines and chemokines in cultured J774A.1 macrophages [J]. Bioorg Med Chem Lett, 2012, 22(9): 3177-3180.

[16] 李林, 晏永明, 李小年, 等. 虫类中药蛴螬中含氮化合物研究[J]. 天然产物研究与开发, 2013, 25(3):329-332.

[17] 李德海, 顾谦群, 朱伟明, 等. 海洋放线菌 11014中抗肿瘤活性成分的研究 I. 环二肽[J]. 中国抗生素杂志, 2005, 30(8): 449-468.

[18] 崔美子, 巩婷, 朱平. 丰肉结海绵相关链霉菌 LS298活性代谢产物研究[J]. 中国医药生物技术, 2012, 7(6):418-425.

[19] 李俊, 李永爱, 许晶, 等. 中国南海网状软珊瑚化学成分研究[J]. 中国海洋药物杂志, 2011, 30(3): 31-36.

[20] 石瑛, 田黎, 王婧, 等. 海洋放线菌 Micromonospora sp.与细菌Oceanospirillum sp.发酵液中化学成分的研究[J]. 中国海洋药物杂志, 2006, 25(1): 6-10.

[21] 赵明, 韩晶, 吕嵩岩, 等. 紫丁香树枝化学成分研究[J]. 中草药, 2012, 43(2): 251-254.

[22] 王菲, 袁胜涛, 朱丹妮. 肿节风抗肿瘤活性部位的化学成分[J]. 中国天然药物, 2007, 5(3): 174-178.

[23] Li J T, Yin B L, Liu Y, et al. Mono-aromatic constituents of Dendrobium longicornu [J]. Chem Nat Comp,2009, 45(2): 234-236.

[24] 郭秀春, 郑立, 周文辉, 等. 海洋微生物中二酮哌嗪类化合物的研究进展 [J]. 微生物学通报, 2009,36(10): 1596-1603.

[25] Holden M T G, Chhabra S R, Nys R D, et al.Quorum-sensing cross talk: isolation and chemical characterization of cyclic dipeptides from Pseudomonas aeruginosa and other Gram-negative bacteria [J].Mol Microbiol, 1999, 33(6): 1254-1266.

[26] Li X, Dobretsov S, Xu Y, et al. Antifouling diketopiperazines produced by a deep-sea bacterium, Streptomyces fungicidicus [J]. Biofouling, 2006, 22(3): 187-194.