顶空气相色谱法同时测定灯盏花乙素中5种有机溶剂残留量

2014-12-01董知旭杨兆祥

云南中医学院学报 2014年1期

王相，张伟，董知旭，杨兆祥△

（1.昆明医科大学，云南昆明 650500；2.昆明制药集团股份有限公司，云南昆明 650100）

灯盏花乙素是从灯盏细辛中提取的黄酮类有效成分，结构式鉴定为4，5，6-三羟基黄酮-7-葡萄糖醛酸甙，又名野黄芩苷（以下用SCU表示）（见图1）。目前已经有人工合成灯盏花乙素的研究[1]。人工合成灯盏花乙素过程中使用了甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF等有机溶剂，此5种溶剂均为限制使用的溶剂，必须对其残留量进行考察[2]。因此制定本方法以控制灯盏花乙素中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的残留量。

图1 灯盏花乙素结构式

1 仪器与试药

1.1 仪器

Clarus-600气相色谱仪（美国Perkin Elmer），FID 检测器，DB-1301（30m×0.32mm×1.0μm）毛细管色谱柱，Turbomartrix 40顶空进样器（美国Perkin Elmer），BP221-S 型电子天平（Sartorius）

1.2 试药

灯盏花乙素（SCU）由昆明制药集团股份有限公司提供，批号分别为 20121026，20121029，20121030。DMA、甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF均为色谱纯。

2 色谱条件[3-4]

2.1 溶解介质的选择

由于SCU在碱性水溶液中的溶解性极差，且残留溶剂DMF的沸点为152.3℃，考虑若采用碱性水溶液或水为溶解介质，不仅不能满足SCU的溶解性要求，而且会影响顶空温度的选择，故决定使用有机溶剂为溶解介质。

气相色谱法常用的有机溶解介质有DMA、DMF等，由于残留溶剂有DMF，故选择DMA为溶解介质。

2.2 顶空时间、温度的选择

2.2.1 混合对照品溶液

精密称取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF适量，用DMA稀释成1mL含甲醇0.3mg、乙醇0.5mg、丙酮0.5mg、二氯甲烷0.06mg、DMF0.088mg的混合溶液，即得。

2.2.2 顶空时间的选择

分别设置顶空时间为20，25，30，35，40，45，50min，进样混合对照溶液，结果见表1，由表可知30min时，甲醇、乙醇、二氯甲烷、DMF均达到气液平衡，且丙酮的峰面积达到检测要求，故选择顶空时间为30min。

表1 顶空时间选择结果数据表

2.2.3 顶空温度的选择

分别设置顶空温度为 70，75，80，85，90，95℃，进样2.2.1项下的混合对照溶液，结果见表2。可见随着温度的升高残留溶剂的峰面积均增大，综合考虑高温下样品的稳定性及检测的要求，最终确定顶空温度为90℃。

表2 顶空温度选择结果数据表

2.3 色谱条件的确定

载气为N2，采用线速率模式，流速1.0mL/min；分流比 1∶1；柱温采用程序升温，初始柱温：60℃，保持6min，以70℃/min的速度升温到160℃，保持10min；进样口温度：200℃；氢火焰检测器温度：220℃；顶空温度90℃，进样针温度100℃，传输线温度100℃；顶空保温时间30min。

3 实验内容

3.1 专属性考察

3.1.1 空白溶液

量取DMA5.0mL于10mL顶空瓶，加盖密封，即得。

3.1.2 对照溶液

量取DMA5.0mL于10mL顶空瓶，平行6份，记号为1-6号。其中1号瓶中加1滴甲醇，2号瓶中加1滴乙醇，3号瓶中加1滴丙酮，4号瓶中加1滴二氯甲烷，5号瓶中加1滴DMF，6号瓶中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF各加一滴，加盖密封，振摇混匀，即得。其中1-5号为单一对照，6号为混合对照。

3.1.3 供试品溶液

精密称取1.0g的SCU于10mL容量瓶中，加DMA溶解并定容，即得。

3.1.4 专属性考察

在2.2.4色谱条件下，分别进样空白溶液、对照溶液、供试品溶液，记录色谱图（见图2-A，2-B，2-C）。结果在甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF出峰的保留时间处，在空白和供试品溶液中均无干扰峰出现，且5种残留溶剂彼此之间及与DMA之间互不干扰，分离度均大于1.5，表明专属性良好。

3.2 精密度考察

3.2.1 混合对照品溶液

精密称取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF适量，用DMA稀释成1mL含甲醇0.3mg、乙醇0.5mg、丙酮0.5mg、二氯甲烷0.06mg、DMF0.088mg的混合溶液，即得。

3.2.2 精密度考察

精密量取3.2.1项下的混合对照品溶液5.0mL于10mL顶空瓶中，平行6份，密封瓶口，顶空进样，测得甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF峰面积的RSD分别为0.89%，0.51%，0.80%，0.70%，1.81%，表明仪器精密度良好。

3.3 重复性考察

图2 空白溶液（A）、对照品溶液（B）、供试品溶液（C）气相色谱图

按照3.2.1项下方法平行配置混合对照品溶液6份，每份精密量取5.0mL，分别置于6个10mL顶空瓶中，密封瓶口，顶空进样，结果甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF峰面积的RSD分别为0.73%、0.77%、0.50%、0.87%、2.27%.结果表明方法的重复性良好。

3.4 最低检测限和最低定量限

3.4.1 单一对照品溶液

精密称取甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF适量，分别置于5个顶空瓶中，用DMA稀释成1mL含甲醇0.3mg、乙醇0.5mg、丙酮0.5mg、二氯甲烷0.06mg、DMF0.088mg的对照品溶液，即得。

3.4.2 最低检测限和最低定量限的测定

取3.4.1项下的单一对照品溶液，逐步稀释，精密量取5.0mL于10mL顶空瓶中，立即密封，顶空进样，记录色谱图，计算主峰信噪比，测得甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的最低检测限和最低定量限见下表（表 3）。

表3 5种残留溶剂最低定量限和最低检测限的测定结果（单位：μg/mL）

3.5 线性范围考察

3.5.1 对照品储备液的制备

精密量取甲醇60mg、乙醇100mg、丙酮100mg、二氯甲烷12mg、DMF17.6mg于100mL容量瓶中，DMA稀释、定容作为对照品储备液。

3.5.2 标准曲线的绘制

精密量取对照品储备液适量，用DMA稀释成一系列对照品溶液，使甲醇的浓度在0.003~0.450mg/mL，乙醇浓度在 0.005~0.750mg/mL，丙酮浓度在0.005~0.750mg/mL，二氯甲烷浓度在0.0006~0.0900mg/mL，DMF浓度在0.0086~0.1320mg/mL。每个对照品溶液精密量取5mL置于10mL顶空瓶中，在“2.3”项色谱条件下进样，记录色谱图，以浓度为横坐标，对照峰面积为纵坐标进行线性回归，回归方程和线性范围见表4。

表4 回归方程及线性范围

3.6 回收率考察

3.6.1 80%、100%、120%对照品溶液的配制

精密量取3.5.1项下的对照品储备液10mL、50mL、15mL，分别置于 25mL、100mL、25mL 的容量瓶中，DMA稀释定容，即得。

3.6.2 回收率测定

精密量称取灯盏花乙素（批号：20121030）250mg于顶空瓶中，平行12分，记为1-12号，其中1-3号精密加入空白DMA5mL，4-6号精密加入80%对照品溶液5mL，7-9号精密加入100%对照品溶液5mL，10-12号精密加入 120%对照品溶液5mL，加盖密封，进样，测定回收率。结果甲醇的平均回收率为100.89%，RSD为1.16%；乙醇的平均回收率为102.68%，RSD为1.33%；丙酮的平均回收率为103.22%，RSD为1.75%；二氯甲烷的平均回收率为100.75%，RSD为 0.84%，DMF的平均回收率为99.15%，RSD为3.40%.

3.7 稳定性考察

精密量取灯盏花乙素适量，用DMA溶解稀释成浓度为100mg/mL的供试品溶液，取3.6.1项下的100%对照品溶液作为对照品溶液，分别在0，2，4，8，12，16h 时进样，记录色谱图，结果对照品溶液中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的RSD分别为 1.34%、2.23%、0.74%、1.31%、4.72%；样品溶液中甲醇、乙醇、丙酮的RSD分别为2.91%、1.87%、0.95%（样品中无二氯甲烷和DMF）。说明样品及对照的稳定性良好。

3.8 样品测定

精密量取3批SCU样品，各约1.0g，加DMA溶解并定容至10mL容量瓶中，精密量取5mL于顶空进样小瓶中，按2.3项下的色谱条件进行测定，同时测定混合对照，按外标法计算，结果见表5。《中国药典》（2010版）规定药品中残留溶剂甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、DMF的限度分别为0.3%、0.5%、0.5%、0.06%、0.088%，由表可知3批SCU中5中溶剂的残留量均在限度范围内，符合标准。