替考拉宁的HPLC法测定

耿艳辉，刘素彦，贺广锋

(微生物药物国家工程研究中心/华北制药集团新药研究开发有限责任公司，河北石家庄050015)

替考拉宁(teicoplanin)是继万古霉素、去甲万古霉素之后的又一新型抗耐药菌糖肽类抗生素，是由10个或11个碳脂肪链组成的复杂化合物，由 5个结构相似的 TA2－1、TA2－2、TA2－3、TA2－4、TA2－5组成，分子量分别为1878，1880，1880，1 894，1 894，其中 TA2－2为主要成分，占各组分相对含量的40%以上［1－4］。由于替考拉宁化学结构复杂，组分较多，因此需要建立快速、准确、精密的分析方法，适用于替考拉宁生产过程中选种、发酵、提炼、精制的中间过程检测。目前《中国药典》(2010 版)［5］、《日本药典》(JP16)［6］、《欧洲药典》(EP7.0)［7］均登载了替考拉宁各组分含量测定方法，TA2－2出峰时间一般在18～24 min，整个色谱采集时间为40～45 min，分析时间较长，不适合生产过程的中间质量控制分析。本文建立了梯度反相高效液相色谱分析法，用于检测替考拉宁生产过程中的中控样品，同时与《中国药典》(2010版)方法测定结果作了比较，现将结果报道如下。

1 仪器与试药

Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪;Agilent 1260 VWD紫外检测器;Agilent ChemStation色谱工作站;Mettler toledo XS205电子天平。替考拉宁标准品，批号:130374－201002，含量为89.4%，中国食品药品检定研究院;乙腈、三乙胺为色谱纯，无水磷酸二氢钠、氢氧化钠为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 溶液配制 ①标准品溶液:精密称取替考拉宁标准品28 mg，用水溶解定容至50 mL容量瓶中，得溶液浓度为0.5 g/L。②发酵供试品溶液:精密称取一定量的发酵液，用1 mol/L氢氧化钠调节发酵液pH值到10±0.1，搅拌15 min后，离心取上清液，用1 mol/L盐酸调pH值到6.5±0.1，再取一定量上述溶液用水稀释至溶液浓度为0.5 g/L。③提炼供试品溶液:取一定量的解析液用水稀释至溶液浓度为0.5 g/L。④粗粉供试品溶液:取一定量的粗粉用水溶解定容至50 mL容量瓶中，得溶液浓度为0.5 g/L。按色谱条件对标准品溶液、发酵供试品溶液、提炼供试品溶液、粗粉供试品溶液各进样20 μL进行测定，按外标法以5个组分峰高之和计算替考拉宁含量。

2.2 色谱条件 色谱柱:Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流速为 1.0 mL/min;柱温为 40 ℃;检测波长为254 nm;进样量为20 μL;流动相为3.0 g/L无水磷酸二氢钠缓冲液－乙腈，梯度洗脱程序见表1。流动相配制:缓冲液，称取3.0 g无水磷酸二氢钠溶解于1 000 mL水中，加1 mL三乙胺，混匀后用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至6.5±0.1。A相:量取缓冲液900 mL，再加入100 mL乙腈，混匀。B相:量取950 mL乙腈，再加入50 mL水，混匀。在上述条件下，分别取标准品溶液、发酵供试品溶液、粗粉供试品溶液各20 μL进样测定，色图谱见图1～3。

表1 流动相梯度洗脱程序

图1 标准品色图谱

图2 发酵液色谱图

图3 粗粉色谱图

2.3 线性试验 称取替考拉宁标准品适量，用水溶解配制成系列替考拉宁标准品溶液，按试验方法对标准溶液系列进行测定，替考拉宁质量浓度在0.1～1.0 g/L浓度范围内与峰高呈线性，以质量浓度X(g/L)为横坐标，峰高Y(mV)为纵坐标，进行线性回归得线性方程为Y=499.52X+4.39，相关系数为 0.999 9。

2.4 回收率试验 取已知浓度的替考拉宁粗粉供试品溶液(0.503 7 g/L)6 mL 9 份，分别加入1，2，3 mL 替考拉宁标准品溶液(1.004 3 g/L)各3份，再用水定容至10 mL容量瓶中，按试验方法进行测定，回收率结果见表2。

表2 替考拉宁加样回收率试验结果(n=9)

2.5 溶液稳定性试验 标准品溶液、发酵供试品溶液、提炼供试品溶液、粗粉供试品溶液配制后于室温下放置，分别在0，2，4，6，8 h按色谱条件进样测定，替考拉宁5个组分峰高之和的相对标准偏差分别为 0.35%，0.68%，0.63%，0.57%，结果表明各测试溶液8 h内稳定。

2.6 精密度试验

2.6.1 重复性 分别取发酵供试品溶液、提炼供试品溶液、粗粉供试品溶液，按色谱条件各平行测定6次，替考拉宁5个组分峰高之和的相对标准偏差分别为0.52%、0.44%、0.49%，方法具有良好的重复性。

2.6.2 中间精密度 由不同分析人员交替使用两台Agilent Technologies 1260 Infinity高效液相色谱仪按试验方法测定同一批次粗粉，每次平行测定双份，共测定3次。按外标法计算替考拉宁粗粉含量分别为 85.63%，85.01%，86.31%，86.84%，86.96%，85.59%，RSD 为 0.90%(n=6)。

2.7 样品测定 取替考拉宁发酵液、提炼液、粗粉，按“2.1”项下方法制备各供试品溶液，分别用本方法和中国药典2010版方法进样测定，按外标法以替考拉宁五个组分峰高之和计算含量，结果两方法检测结果的相对平均偏差均在2.0%以内，本方法检测结果可靠，见表3。

表3 供试品检测结果比较

3 讨 论

选用国内外不同品牌的十八烷基键合硅胶色谱柱5支进行试验，色谱柱分别为 Welchrom C18，GALAK EF－C18(H)，Waters Symmetry C18，InertSustain C18和 Kromasil 10 － 5C18，结果表明Waters Symmetry C18色谱柱分离效果相对较好，TA2－2与TA2－3间的分离度均大于1.3，TA2－4与TA2－5间的分离度均大于1.2，且以TA2－2计算理论塔板数均大于10 000。

替考拉宁5个结构相近的化合物中均含有1个羧基和1个氨基，系两性化合物，等电点为5.1［8］，为了增加替考拉宁在流动相中的溶解性，试验分别调节缓冲液pH值为5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，结果表明缓冲液 pH 值为 6.5 时，5 个组分峰形尖锐且分离效果最好，故流动相配制及发酵液供试品配制时均调 pH 值为6.5±0.1。

替考拉宁结构中含有羟基和羧基，导致5个组分色谱峰拖尾较严重，为改善峰形，流动相中加入0.1%三乙胺来抑制峰形拖尾，最终得到了峰形尖锐对称的色谱峰。本检验方法回收率高、精密度好、适用性强，可用于替考拉宁生产过程中的中控样品及粗粉的含量检测。

［1］邓晶晶，卫薇.糖肽类抗生素替考拉宁的分析方法研究进展［J］.西南军医，2009，11(5):925－926

［2］祝仕清，牛长群.替考拉宁中主要组分的LC－MS法测定［J］.分析测试学报，2008，27(11):23 －25

［3］张波.发酵液中替考拉宁含量的HPLC法测定［J］.中国实用医药，2011，23(6):38 －39

［4］薛晶，常艳，邹文博，等.注射用替考拉宁的组分分析［J］.中国抗生素杂志，2010，35(11):848 －852

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:916－917

［6］The Ministry of Health，Labour and Welfare.Japanese Pharmacopoeia Sixteenth Edition［S］.Tokyo:The Ministry of Health，Labour and Welfare，2011:1466 －1469

［7］European Pharmacopoeia Commission.European Pharmacopoeia-7th Edition［S］.Strasbourg:European Directorate for Quality Medicines，2010:3038 －3040

［8］杨红，秦川萍.HPLC法测定替考拉宁组分和有关物质［J］.中国抗生素杂志，2006，31(3):184 －186