Wnt诱导分泌蛋白－1与克罗恩病肠壁纤维化关系的临床研究

徐正磊，王立生，梅 毅，廖碧红，师瑞月，张 茹

(广东省深圳市人民医院，广东深圳518000)

克罗恩病(CD)是一种胃肠道慢性非干酪性肉芽肿性炎症，病变可以累及肠壁全层，肠壁增厚变硬，肠腔狭窄［1］。肠腔狭窄后容易出现肠梗阻，肠梗阻的大部分患者需要外科手术治疗，而且手术后容易复发。肠壁纤维组织增生引起的肠壁纤维化是肠壁增厚变硬、肠腔狭窄的重要原因［2］。目前CD肠壁纤维化的发生机制仍不完全清楚。研究显示，TGF-β、TNF-α、CTGF、IGF-1和 ICAM-1等细胞递质在 CD 引起的肠壁纤维化过程中起到重要的作用。最新研究表明，Wnt诱导分泌蛋白-1(WISP-1)与肺、心脏、肝脏等器官的纤维化相关［3］。本研究探讨了WISP-1与CD肠壁纤维化的关系，为CD合并纤维化的治疗提供新的靶点。

1 临床资料

1.1 一般资料 选取2012年3月—2013年3月本院收治的CD合并肠梗阻行手术患者20例作为CD组，选择本院体检部体检健康的20例作为对照组。CD组病例均来自本院，并符合世界卫生组织(WHO)制定的CD诊断标准［4］:在排除肠结核、阿米巴痢疾、耶尔森菌感染等慢性肠道感染、肠道淋巴瘤、憩室炎、缺血性肠炎、白塞病以及溃疡性结肠炎等基础上，同时具备下述①②③项再加上④⑤⑥之一项;或者具有④项，再加上①②③中任意2项。①非连续性或区域性肠道病变;②肠黏膜成铺路石表现，或有纵行溃疡;③全层炎症性肠道病变，伴有肿块或狭窄;④结节病样非干酪性肉芽肿;⑤裂沟或瘘管;⑥肛门病变，有难治性溃疡、肛瘘或肛裂。排除肺、心脏和肝脏疾病，排除高血压和糖尿病，无长期服药物及吸烟酗酒史。CD组男9例，女11例;年龄20～52(34.43±10.29)岁。对照组男8例，女12例;年龄22～50(35.25±9.63)岁。2组在性别、年龄方面比较无显著性差异(P均＞0.05)，具有可比性。

1.2 方法 ①检测肠壁WISP-1。20例CD患者为节段性、跳跃性肠道病变，手术切除的肠道一般同时存在病变肠壁和正常肠壁，组织离体后30 min内取材，一部分标本经液氮速冻后置于-70℃烫冰箱保存备用，剩余标本经甲醛固定用于制作石蜡块。针对同一患者病变与正常肠壁，均采用实时荧光定量RT-PCR法对WISP-1 mRNA表达水平做相对定量分析;采用免疫组化中的蛋白印迹法(Western-blot)检测WISP-1蛋白表达水平。②检测外周血WISP-1。提取所有受检者的外周血标本，均采用早晨空腹静脉血;购买人WISP-1 ELISA测定试剂盒，利用ELISA法测定外周血WISP-1水平。

1.3 统计学处理 采用SPSS 14.0统计学软件处理，年龄、WISP-1水平等计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验;性别等计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 正常肠壁组与病变肠壁组WISP-1水平比较 病变肠壁组WISP-1 mRNA表达水平与WISP-1蛋白表达水平明显高于正常肠壁组(P均＜0.05)，见表1。

表1 正常肠壁组与病变肠壁组WISP-1水平比较(±s)

表1 正常肠壁组与病变肠壁组WISP-1水平比较(±s)

组别 n WISP-1 mRNA表达水平 WISP-1蛋白表达水平正常肠壁组20 37.85 ±14.42 1.48 ±0.36病变肠壁组 20 26.53 ±9.26 1.01 ±0.09 t 4.382 3.944 P ＜0.05 ＜0.05

2.2 CD组与对照组血清WISP-1水平比较 CD组血清WISP-1 水平为(70.63 ±16.27)μg/L，明显高于对照组的(56.53 ±10.62)μg/L(P ＜0.05)。

2.3 WISP-1 mRNA表达水平 见图1和图2。

2.4 WISP-1在CD病变肠壁中的表达情况 见图3。

3 讨 论

CD最早于1932年由 Crohn、Oppenheime和 Ginzterg描述，曾被称为“慢性肠壁全层炎”、“节段性肠炎”、“局限性肠炎”等。1973年，WHO将该病命名为克罗恩病［5］。CD是一种消化道非特异性、慢性透壁性炎症，病变呈节段性分布，病情反复发作，以回肠末端最为常见，另外，结肠和肛门病变也较多［6］。

CD可以导致大量细胞外基质(ECM)的异常沉淀，从而导致肠壁全层均发生纤维化，从而引起狭窄，最终导致肠梗阻。有研究表明，40%以上CD有程度不等的肠梗阻，且反复发生，80%的患者最终需要手术治疗［7］。目前CD的大部分治疗药物都不可逆转已发生的肠壁纤维化，致使大部分患者需要外科手术或者内镜治疗，但手术及内镜干预治疗复发率高，并非最好的治疗手段。

图1 CD组肠壁组织中总mRNA提取物电泳图

图2 CD组WISP-1 PCR产物凝胶电泳图

图3 WISP-1在CD病变肠壁中的表达

近年研究发现，慢性炎症是肠壁纤维化的继发因素之一［8］。炎性细胞的浸润，氧自由基等活性物质的释放进一步激活成纤维母细胞分泌更多的胶原蛋白和弹性蛋白，在肠壁内沉积，导致了肠壁的纤维化。CD是肠道的慢性炎症，肠道间质细胞活化为成纤维母细胞，导致大量ECM的异常沉淀［9］。上皮间质转化(EMT)在组织器官纤维化过程中起重要作用，如肾小管［10］、肝脏上皮细胞［11］、胆管上皮细胞［12］和腹膜间皮细胞［13］。④最新研究发现，WISP-1可能与CD的肠壁纤维化密切相关。WISP-1是Wnt信号通路活化后的下游靶基因之一，属于高半胱氨酸蛋白61、结缔组织生长因子、肾母细胞瘤过度表达基因(CCN)家族成员，是一种富含半胱氨酸的长度为367个氨基酸的分泌性蛋白多肽，其相对分子质量约为40 000，可由成纤维母细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和心肌细胞等多种细胞合成分泌。WISP-1是促纤维化发生的主要细胞因子，WISP-1与细胞表面核心蛋白聚糖(DCN)结合后参与器官纤维化的发生。WISP-1在肺癌、肺纤维化、骨与软骨形成及心肌梗死中都呈高表达，是这些疾病异常增生和纤维化的关键因子［13］。Sunita Sharma等［14］用基因筛选的方法首次发现WISP1同哮喘有关。Singanayagam［15］研究发现，WISP1作为一种新型的肺泡上皮细胞损伤和修复的调节因子，在促进肺纤维化过程中起重要作用，拮抗WISP1可以抑制肺纤维化的发生。Lewis等［16］利用基因芯片检测发现博莱霉素导致的肺纤维化模型中WISP-1mRNA的表达水平显著增加，具有统计学意义。Colston［17］行左前降支冠脉闭塞雄性小鼠心肌梗死造模，利用免疫印迹和Northern法检测WISP-1的蛋白表达水平，发现心肌组织中WISP-1的表达水平逐渐升高，在24 h达到最高峰;WISP-1可以促进心肌中成纤维母细胞增殖及胶原合成;WISP-1促进心肌成纤维母细胞增殖作用通过TNF-α介导，TNF-α通过cAMP反应元件结合蛋白(CREB)依赖途径诱导心肌成纤维母细胞WISP-1表达，TNF-α通过细胞外调节蛋白激酶(ERK1)/2诱导CREB活化，抑制ERK1/2和CREB，可以抑制TNF-α介导的WISP-1的表达，WISP-1基因沉默减弱TNF-α的促进心肌成纤维母细胞增殖及胶原合成的作用。熊伍军等［18］发现肝纤维化模型的肝组织中WISP-1的表达水平较正常组高11.6倍。

本研究结果显示CD患者病变肠壁WISP-1 mRNA表达水平与WISP-1蛋白表达水平明显高于正常肠壁，CD组患者血清WISP-1水平明显高于对照组，说明WISP-1与CD的肠壁纤维化关系密切，其发生机制有待进一步深入研究，希望可以为CD肠壁纤维化的治疗提供新的靶点。

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