bFGF体外诱导大鼠BMSCs分化为心肌样细胞

于艳囡，王海萍，吕 洋

(河北北方学院 组织学与胚胎学教研室, 河北 张家口 075000)

bFGF体外诱导大鼠BMSCs分化为心肌样细胞

于艳囡，王海萍*，吕 洋

(河北北方学院 组织学与胚胎学教研室, 河北 张家口 075000)

心血管病严重危害人类健康，各种因素作用于心肌细胞均可引起不可逆性损伤，干细胞培养有望从根本上治疗这一疾病。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有强大增殖和分化能力，BMSCs在不同的诱导剂作用下可以向骨细胞、心肌细胞等分化[1]。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)具有激活心肌细胞增生的潜能,bFGF促进细胞增生的作用与其浓度有一定关系。本实验旨在用不同浓度bFGF对大鼠BMSCs进行体外诱导，并探究其有效性，寻找最适浓度。

1 材料与方法

1.1 动物和试剂:SPF级3周SD大鼠(20～30 g)，雌雄均可(河北医科大学 合格证号：908134)。IMDM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(兰州民海公司)，α-actin，desmin(北京博奥森公司)， cTnT(NeoMark公司)，免疫细胞化学染色试剂盒(北京四正柏公司)。

1.2 方法

1.2.1 分离BMSCs纯化扩增培养：取大鼠四肢长骨，冲出骨髓液过滤接种于培养瓶，调整细胞于培养箱中培养。24 h后换液，此后每3天换液1次，贴壁细胞达90%汇合时消化，接种传代。第2代培养48 h后，A、 B和C组分别加0.5、 1和2 ng/mL bFGF，D组空白对照。诱导3 d后去除诱导，普通培养基培养4周。

1.2.2 心肌标志鉴定：培养的细胞PBS洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，再洗3次，山羊血清封闭1 h，分别加入 α-横纹肌肌动蛋白(α-actin)、结蛋白desmin和心肌肌钙蛋白T(cTnT)，4 ℃孵育过夜，加PBS作空白对照，其他步骤按试剂盒说明，最后苏木素复染，乙醇脱水，中性树脂固定,显微镜下观察。

1.2.3 免疫荧光检测：取培养的B组细胞爬片，然后按试剂盒说明书操作，激光扫描共焦显微镜下观察。另将第1个一抗换成cTnT，其余步骤同上。

1.2.4 透射电镜观察：培养的B组细胞消化，PBS悬浮，90×g离心，洗3次，2 100×g离心，细胞团置戊二醛(2.5%)40 ℃固定，PBS冲洗，1%鋨酸固定30 min，PBS冲洗，逐级丙酮脱水，包埋，切片，透射电镜观察。

1.3 统计学分析:应用SPSS分析资料，免疫细胞化学各指标阳性率比较用卡方检验。

2 结果

2.1 BMSCs的培养:诱导培养后B组细胞呈短柱状，相邻细胞紧密接触，A、C组不明显，D组为成纤维细胞样(图1)。

A.BMSCs were cultured for 28 days in group D;B.BMSCs were cultured for 28 days in group B图1 倒置相差显微镜观察骨髓间充质干细胞Fig 1 The cultured cells observed under phase contrast microscope(×200)

2.2 免疫细胞化学鉴定: 诱导细胞可见 α-actin、desmin及cTnT阳性，D组为阴性。B组细胞中α-actin、desmin和cTnT阳性率最高，分别为 58.73%、34.14%和25.34%；A组分别为46.71%、28.52%和17.25%；C组为 47.65%、29.15% 和16.31%(图2)。

2.3 荧光免疫化学鉴定:B组中培养细胞,胞质内α-actin的表达呈红色，cTnT的表达呈绿色，两者同时观察时重叠的部分呈黄色(图3)。

2.4 透射电镜观察:透射电镜下观察B组中分化细胞呈分支杆状，核椭圆，胞质内有平行排列的肌丝、核糖体和线粒体等，总体呈类心肌细胞样(图4)。

3 讨论

bFGF为体内细胞因子，能够实现中胚层细胞的快速增殖和分化，低浓度的bFGF对分化有促进作用[2]，所以对bFGF在低浓度进行限定，结果B组中28 d即形成类心肌细胞样结构，而对照组为成纤维细胞样，说明bFGF可诱导BMSCs分化为心肌样细胞。

α-横纹肌肌动蛋白能够特异性地识别骨骼肌和心肌，结蛋白是心肌特异性的中间纤维蛋白[3]，心肌肌钙蛋白T具有较高的心肌特异性。

实验结果中α-actin、desmin、cTnT的阳性率值及比较说明， BMSCs可被诱导成肌源性细胞，其中包括骨骼肌细胞和心肌细胞,培养浓度1 ng/mL较合适。

A.the expression of α-actin after 4 weeks induction in group B; B.the expression of desmin after 4 weeks induction in group B; C.the expression of cTnT after 4 weeks induction in group B; D.the expression of α-actin after the same time in group D; E.the expression of desmin after the same time in group D; F.the expression of cTnT after the same time in group D

图2BMSCs的免疫细胞化学染色结果
Fig2ImmunohistochemicalstainingofBMSCs(×400)

A.red light was signed to α-actin; B.green light was signed to cTnT; C.they were both been showed,it changed to yellow图3 免疫荧光化学鉴定结果Fig 3 Results of laser scanning confocal microscopy(×400)

A.B.a lot of glycogen,ribosome and paralled myofilament were founded in plasm图4 透射电镜观察结果Fig 4 Results of tranmission electron microscope

对分化率较高的B组免疫荧光检测和透射电镜观察，证实了诱导的有效性。

综上所述，bFGF能在体外诱导BMSCs分化为心肌细胞，且1 ng/mL可能是最适诱导浓度。

[1] Behfar A, Yamada S, Crespo-Diaz R,etal.Guided acardiopoiesis enhances therapeutic benefit of bone marrow human mesenchymal stem cells in chronic myocardial infarction[J]. Am Coll Cardio, 2010,56:735- 737.

[2] Wojakowski W，Tendera M. New concepts in cardiac stem cell therapt[J]. Hellenic Cardiol,2010,51:10- 14.

[3] 陈小波，余祖滨，闵家新，等.大鼠心肌挫伤后细胞结蛋白破坏与盖超载的实验研究[J].第三军医大学学报，2011,33:991- 994.

2013- 04- 25

2013- 11- 28

河北省教育厅科学技术研究重点项目(ZH2012001)；河北北方学院创新人才培育基金(CXRC1315)；河北北方学院青年基金(Q2013027)

*通信作者(correspondingauthor)： haipingmimi@126.com

1001-6325(2014)08-1101-03

R 3

A