RGD和细胞穿膜肽共修饰脂质体的构建及其体外功能评价

赵炳芬

(胜利油田 中心医院 肿瘤科， 山东 东营 257034)

研究论文

RGD和细胞穿膜肽共修饰脂质体的构建及其体外功能评价

赵炳芬*

(胜利油田 中心医院 肿瘤科， 山东 东营 257034)

目的制备RGD和TAT共修饰载紫杉醇(PTX)脂质体(RGD/TAT-LP-PTX)，研究其理化性质和体外抗肿瘤作用。方法薄膜分散法制备RGD/TAT-LP-PTX，研究其理化性质；检测肝癌HepG2细胞对RGD/TAT-LP的摄取效率以及脂质体的摄取机制。共聚焦实验研究肿瘤细胞对脂质体的摄取。MTT检测RGD/TAT-LP-PTX对HepG2细胞的增殖抑制作用。结果RGD/TAT-LP-PTX的粒径134.5±8.4 nm，电位为22.35±2.55 mV，紫杉醇的包封率84.6%。RGD/TAT-LP在4 h摄取效率是2 h的1.65倍(P< 0.05)；HepG2细胞在4 h对RGD/TAT-LP的摄取效率分别是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P< 0.01)；RGD/TAT-LP-PTX在24 h HepG2细胞的存活率是48 h的1.75倍(P< 0.05)；给药48 h后，TAT-LP-PTX、RGD -LP-PTX和LP-PTX的细胞存活率分别是RGD/TAT-LP-PTX组的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P< 0.01)。结论RGD和TAT共修饰紫杉醇脂质体是一种潜在高效的肿瘤靶向给药系统。

整合素受体；细胞穿膜肽；脂质体；肿瘤靶向

在过去几十年，随着现代生物研究的进展，对肿瘤疾病的治疗手段日益丰富。其中肿瘤的靶向治疗成为了肿瘤治疗研究的热点[1]。脂质体是最常用的一种靶向给药载体，具有良好的生物相容性，可表面修饰实现主动靶向[2]。TAT作为一种强效的细胞穿膜肽(cell penetrating peptides，CPP)被广泛应用于纳米载体的研发中，以提高纳米载体的入胞能力[3]。有研究表明，肿瘤细胞表面有整合素受体高度表达[4]。本研究以脂质体为载体，制备了RGD和细胞穿膜肽共修饰紫杉醇脂质体，并对其理化性质和体外活性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

大豆磷脂(SPC，上海太伟药业有限公司)；胆固醇(Chol，Sigma公司)；DSPE-PEG2000和FITC标记的磷脂(Avanti polar lipids公司)；DMEM高糖培养基和胎牛血清(Gibco公司)；其余试剂为分析纯。人源肝癌细胞(HepG2，ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 肝癌HepG2细胞的培养：将HepG2细胞置于含有100 mg/L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5% CO2，饱和湿度，温度为37 ℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5 mg/L胰蛋白酶消化传代，取增殖期细胞进行实验。

1.2.2 RGD/TAT-LP-PTX的制备及其表征:参照文献[5- 6]方法合成DSPE-PEG2000-RGD和DSPE-PEG2000-TAT。将处方量的紫杉醇，SPC，Cho，DSPE-PEG3500-RGD，DSPE-PEG2000-TAT，DSPE-PEG-OMe(保证总磷脂∶胆固醇=75∶25(摩尔比)，分别溶于三氯甲烷，置50 mL茄形瓶中旋转蒸发成膜后，真空干燥器中过夜。加入2.5 mL PBS缓冲液(pH 7.4)，置空气浴摇床中，37 ℃，180 r/min，20 min水化，水浴超声5 min脱膜，探头超声制备得到RGD与TAT共修饰的紫杉醇脂质体或者FITC标记脂质体。

采用葡萄糖凝胶柱色谱法分离脂质体与未包载的紫杉醇，将过柱后的脂质体采用triton-100破乳，用HPLC法在227 nm检测紫杉醇含量。按照EE%=W包/W投×100%计算包封率。W包：脂质体中包载的药物量。W投：制备脂质体的投药量。

1.2.3 RGD/TAT-LP-PTX的血清稳定性:取脂质体样品500 μL，每个样品3份。分别与等体积的磷酸盐缓冲液、含有50%胎牛血清的磷酸盐缓冲液混合，于37 ℃下孵育1、4、8、12和24 h，分别测定其在750 nm的透光率。以样品在磷酸盐缓冲液中的透光率值为空白，以样品在含有50%FBS的磷酸盐缓冲液中的透光率与其在磷酸盐缓冲液中透光率的比值来评价纳米粒在血清中的稳定性。

1.2.4 HepG2细胞对FITC标记脂质体的摄取及摄取机制：将对数生长期的细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，37 ℃培养24 h后，每孔加入适量FITC标记的LP、TAT-LP、RGD-LP和RGD/TAT-LP，使孔中脂质体为0.20 μg/mL，37 ℃分别孵育2和4 h后除去含脂质体培养基，冷PBS清洗3次，0.25%胰蛋白酶消化后离心，PBS清洗3次，流式细胞仪测定细胞荧光值。

为了定性观察细胞对脂质体的摄取，将脂质体与细胞共同孵育4 h后，将细胞用PBS漂洗3次，加入2 μg/mL 4′,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐溶液，室温孵育20 min，加冰PBS漂洗3次，加4%多聚甲醛固定15 min，弃去多聚甲醛，置激光共聚焦显微镜观察细胞摄取。

为了检测脂质体的摄取机制，将对数生长期的细胞以5×105个/孔接种于6孔板中，37 ℃培养24 h后，每孔加入适量FITC标记的LP、TAT-LP、RGD-LP和RGD/TAT-LP，使孔中脂质体为0.20 μg/mL，分别控制温度、多聚赖氨酸以及不同胞吞抑制剂孵育4 h后，流式细胞仪测定荧光值。

1.2.5 MTT检测不同脂质体对肿瘤细胞的增殖抑制作用：培养HepG2细胞接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入无菌过滤后的脂质体，使每孔为6.5 μmol/mL。将孔板移入37 ℃ CO2孵箱中培养24和48 h后取出，每孔加入20 μL 5 g/L MTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h，将孔板中液体倒出，每孔加入200 μL DMSO，37 ℃避光振摇15 min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的吸光度(A)值。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 脂质体的表征

取适量脂质体用磷钨酸染色，采用透射电镜(TEM)观察形态(图1)，制备的脂质体成球状，形态均一。紫杉醇的包封率为84.6%，粒径和电位(表1)。

图1 RGD/TAT-LP-PTX的透射电镜照片Fig 1 Transmission electron microscopy image of the RGD/TAT-LP-PTX(×10 000)

formulationsize/nmPDIzeta⁃potential/mVLP988±540130±0050-252±356RGD⁃LP1119±1040120±0030 282±216TAT⁃LP1155±980110±00602182±313RGD/TAT⁃LP1345±840140±00502235±255

2.2 脂质体的血清稳定性

各组脂质体在50%的血清中的透光率与其在PBS中的透光率的比值均大于90%，表明4种脂质体24 h在血清中均具有较好的稳定性(表2)。

2.3 HepG2细胞对脂质体的摄取和摄取机制

RGD/TAT-LP在4 h摄取效率是2 h的1.65倍(P< 0.05)(图2)。肝癌HepG2细胞在与脂质体共同孵育4 h后对RGD/TAT-LP的摄取效率分别是TAT-LP、RGD-LP和LP的2.2倍、2.7倍和3.9倍(P< 0.01)；RGD/TAT-LP组荧光强度显著强于其他组(图3)。4 ℃条件下，RGD/TAT-LP的摄取下降88%，NaN3使脂质体的摄取下降19%。多聚赖氨酸使脂质体的摄取下降55%。秋水仙素和氯丙嗪分别使脂质体的摄取下降15%和45% (图4)。

*P< 0.01 compared with RGD/TAT-LP at 2 hours;#P< 0.01 compared with RGD-LP,TAT-LP and LP图2 HepG2细胞不同时间对不同脂质体的摄取效率Fig 2 Uptake of different liposomes by HepG2 cells

2.4 不同脂质体抑制HepG2细胞的增殖

RGD/TAT-LP-PTX对肝癌HEPG2细胞的增殖抑制率随着时间的延长而增长，RGD/TAT-LP-PTX在24 h肝癌HepG2细胞的存活率是48 h的1.75倍(P< 0.01)；在给药48 h后，TAT-LP-PTX、RGD-LP-PTX和LP-PTX的细胞存活率分别是RGD/TAT-LP-PTX组的1.65倍、1.74倍和2.1倍(P< 0.01)(图5)。

表2 不同脂质体在50% FBS中的透光率变化Table 2 The transmittancy variation of liposomes in 50% FBS

图3 激光共聚焦观察HepG2细胞对FITC标记脂质体的摄取Fig 3 Uptake of FITC labelled liposomes by HepG2 cells based on confocal laser scanning microscopy(×2 000)

*P< 0.05 compared with PBS group图4 各种抑制剂对HepG2细胞摄取的影响Fig 4 Effect of endoeytosis inhibitors on the celluar uptake of liposomes in HepG2 cells

*P< 0.01 compared with saline group； #P< 0.01compared with RGD-LP-PTX and TAT-LP-PTX图5 HepG2细胞在不同脂质体MTT实验中的存活率Fig 5 HepG2cell viability at various drugs at 24 and 48 hours after the treatment

3 讨论

细胞穿膜肽TAT能够穿过与之相接触的任何细胞的细胞膜，而对细胞膜没有损伤[7]。TAT修饰的脂质体用于肿瘤靶向给药已经被广泛研究，然而其缺乏选择性也限制了TAT在全身系统给药中的应用[3]。整合素αvβ3在神经胶质瘤、黑色素瘤和肝癌等多种肿瘤细胞及肿瘤相关的内皮细胞表面高度表达，因此整合素αvβ3常被用作肿瘤靶向的特异性靶点[8]。有研究表明，精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)的三肽序列能够特异性地识别含αv亚基的整合素家族，具有高度亲和力。本研究制备的脂质体通过EPR效应到达肿瘤部位，再通过RGD识别高度表达整合素受体的肿瘤细胞，与细胞结合，通过穿膜肽TAT的高效穿膜作用，进入肿瘤细胞。

本研究制备得到的共修饰脂质体的粒径为130 nm左右，有研究显示，纳米载体的粒径范围在10～150 nm能够有效避开网状内皮系统的吞噬，通过实体瘤的高通透性和滞留效应(enhanced permeability and retention effect，EPR)到达肿瘤组织[2]。在细胞摄取实验中，与普通脂质体相比，经过RGD或者TAT修饰都能够显著增强肿瘤细胞对脂质体的摄取，其中对共修饰脂质体的摄取效率显著高于RGD或者TAT单独修饰的脂质体，这说明二者发挥了协同作用，共同促进入胞。载药系统的细胞毒性以及释药能力等与其细胞摄取途径密不可分，不同配体修饰载体产生的摄取机制不同，因此本研究考察了温度、能力抑制剂NaN3、多聚赖氨酸以及各种胞吞抑制剂对RGD/TAT-LP在HepG2细胞中摄取的影响，从而研究修饰脂质体的细胞摄取机制。结果显示，RGD/TAT-LP的入胞依赖巨胞饮和网格蛋白介导的温度、电荷以及能量依赖的过程。通过肿瘤细胞增殖抑制实验证实经过双配体修饰后脂质体能够增强对肿瘤细胞的增殖抑制能力，这与细胞摄取的实验结果相一致，这说明脂质体的细胞毒性依赖于肿瘤细胞对脂质体的摄取效率。综上所述，RGD/TAT-LP是一种潜在高效的肿瘤靶向给药系统。

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The preparation and characterization of RGD and the function ofcell penetrating peptides co-modified paclitaxel loaded liposomeinvitro

ZHAO Bing-fen*

(Dept. of Oncology，Shengli Oilfield Central Hospital，Dongying 257034, China)

ObjectiveTo prepare RGD and TAT co-modified paclitaxel loaded liposome(RGD/TAT-LP-PTX)for HepG2cells targeting.MethodsThe co-modified liposome was prepared by film-ultrasonic method. The appearance，particle size，Zeta potential were evaluated. The cellular uptake by HepG2cellsinvitrowas used to evaluate the targeting efficiency. The anti-proliferation efficiency of RGD/TAT-LP-PTX was evaluated by MTT assay.ResultsThe particle diameter of the co-modified liposome was 134.5±8.4 nm with the Zeta potential of 22.35±2.55mV. The entrapment efficiency of PTX was 84.6%. The result demonstrated that the co-modified liposome uptakes by HepG2 were 2.2, 2.7 times higher than that of TAT-LP and RGD-LP, respectively.The MTT assay demonstrated that the cell viability of TAT-LP-PTX，RGD-LP-PTX and LP-PTX were 1.65, 1.74 and 2.1 times higher than that of RGD/TAT-LP-PTX respectively.ConclusionsThe co-modified liposome may function as a promising tumor delivery system of antitumor drugs.

integrin receptor；cell penetrating peptides；liposomes；tumor targeting

2013- 12- 24

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)：527236911@qq.com

1001-6325(2014)08-1083-05

R 735.7

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