缺血预处理减少大鼠肝缺血再灌注损伤期间白三烯C4生成

洪芬芳，周 莹，闵庆华，郭发先，陈小兵，吴丽梦，杨树龙*

(南昌大学 1.基础医学院 生理教研室；2.医学实验教学部 寄生虫研究室；3.基础医学院 组织胚胎学教研室；4.附属第一医院 妇产科, 江西 南昌 330006)

缺血预处理减少大鼠肝缺血再灌注损伤期间白三烯C4生成

洪芬芳1,2，周 莹3，闵庆华4，郭发先1，陈小兵1，吴丽梦1，杨树龙1*

(南昌大学 1.基础医学院 生理教研室；2.医学实验教学部 寄生虫研究室；3.基础医学院 组织胚胎学教研室；4.附属第一医院 妇产科, 江西 南昌 330006)

白三烯(leukotrienes,LTs)是经5-脂氧化酶(5-lipoxygenase，5-LO)途径产生的一类重要前炎症花生四烯酸类物质。它包括半胱氨酰白三烯(cysteinyl leukotrienes, Cys-LTs)(LTC4、LTD4 和LTE4)以及LTB4。Cys-LTs母体复合物LTC4由肝微粒体白三烯C4合酶(leukotriene C4 synthase, LTC4S)、谷胱甘肽S转移酶(microsomal glutathione S-transferase, mGST)mGST2和mGST3催化LTA4和还原型谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH) 结合而成[1]。肝脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfushion, I/R)在肝移植和肝肿瘤切除外科手术中均存在[2]。许多研究提示，肝脏I/R损伤病理机制中涉及LTs。有最近报道，I/R损伤大鼠肝组织LTC4增加部分系由LTC4S表达上调和LTC4合成酶活力增加所致; 而后者主要是由于LTC4S而非mGST2和mGST3[2]。

缺血预处理(ischemia preconditioning, IP)是指肝脏短暂缺血应激能减轻随后的长时间I/R损伤，并提高其再生能力[3]。一系列证据表明，IP 在肝移植等涉及I/R损伤的过程中具有保护作用[4]。但IP减轻肝脏I/R损伤的机制尚未完全阐明。它是否及如何影响大鼠肝I/R损伤期间前炎性因子LTC4生成未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料:清洁级雄性SD大鼠，250～300 g，18只，[南昌大学实验动物中心，编号SCXK(赣)，2008-0001]。 LTA4甲酯、LTC4和前列腺素B2 (PGB2)(Cayman公司)。LTC4S多克隆抗体(Santa Cruz公司)。增强化学发光酶检测试剂盒(Kibbuz Beit Haemek公司)。DAB试剂盒、辣根过氧化物酶联羊抗兔和羊抗鼠抗体(均北京中山生物有限公司产品)。

1.2 方法

1.2.1 肝I/R损伤动物模型：随机将大鼠均分为3组：1)肝脏I/R组，按文献[2]所述，采用Pringle’s操作方法制作大鼠肝脏I/R损伤模型。2)假手术对照组，只麻醉开腹，不阻断肝脏血流；3)IP组，以短暂10 min缺血再灌注10 min作为IP处理，之后开始较长时间60 min缺血和5 h再灌注。

1.2.2 LTC4含量的测定及免疫印迹分析：按文献[1]，采用反向高效液相色谱(HPLC)法测定各实验组肝组织中LTC4含量,及采用免疫印迹法检测对照组、I/R和IP组肝组织LTC4S蛋白表达情况。

1.2.3 免疫组化检查：采用间接免疫过氧化物酶法，进行免疫组化染色检测LTC4S在对照组、I/R和IP组石蜡包埋大鼠肝组织切片表达和定位分布[1]。

1.2.4 LTC4合成酶的活性分析：取肝组织用超速离心法提取肝微粒体酶，在0.1 mol/L，pH 7.4磷酸钾缓冲液中(终体积150 μL)，加底物10 mmol/L GSH和40 μmol/L LTA4 25 ℃孵化15 min后处理，做RP-HPLC分析[2]。

2 结果

2.1 IP对肝脏I/R期间LTC4含量和肝微粒LTC4合成酶活性的影响:与对照组相比，I/R组肝组织中LTC4含量和肝微粒LTC4合成酶的活性显著增加(P<0.01)，IP组上述指标显著回降(P<0.05)(图1)。

2.2 IP对大鼠肝脏I/R期间LTC4S蛋白表达的影响:I/R组LTC4S蛋白表达水平明显高于对照组(P<0.05)，IP组显著回降(P<0.05) (图2)。

2.3 免疫组化染色检查IP对大鼠肝组织LTC4S表达定位分布的影响:对照组肝细胞和血管内皮细胞的LTC4S免疫阳性染色较低(图3A,B)；I/R肝组织内皮细胞和肝细胞LTC4S染色强阳性，并呈现出小叶分布异常(图3C,D)，IP组大鼠肝组织LTC4S染色轻微阳性(图3E,F)。

A.leukotriene C4 content; B.LTC4 synthesis activities of liver microsomes; *P<0.05 compared with control; #P<0.01 compared with I/R图1 对照组、I/R和IP组大鼠肝LTC4的含量及肝微粒体LTC4合成酶活性变化Fig 1 Changes of hepatic Leukotriene C4 content and LTC4 synthesis activities of liver microsomes in control, I/R and IP groups rats (±s, n=6)

A.shows an immunoreactive band corresponding to LTC4S；B.depicts a histogram obtained by densitometric analysis of several immunoblots for LTC4S; *P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with I/R图2 对照组、I/R和IP组大鼠肝组织LTC4S蛋白表达变化Fig 2 Changes of hepatic protein expressions of LTC4S in control, I/R and IP groups rats (±s, n=3)

3 讨论

本实验I/R大鼠肝组织中LTC4生成增加， 与以前的报告一致[5]，还发现，IP处理显著减少I/R损伤期间肝脏LTC4生成，这可能是IP防治肝脏I/R损伤的原因之一。

A,B.show immunohistochemical staining for LTC4S in normal rat liver; C,D.show immunohistochemical staining for LTC4S in I/R group rat liver (arrows); E,F.show immunohistochemical staining for LTC4S in IP group rat liver (arrows)(A,C,E:Bar=100 μm,B,D,F: Bar=50 μm)

图3免疫组化检测各组大鼠肝脏LTC4S蛋白表达和定位分布变化
Fig4ImmunohistochemicaldistributionsofLTC4Sincontrol,I/RandIPratliver

虽然曾有报道大鼠在3，12和24 h再灌注后，肝组织中LTC4S的mRNA表达无显著变化[5]，但笔者最近研究表明，LTC4的生成增加可能部分与肝I/R期间LTC4S过度表达有关[2]。为了进一步阐明IP减少肝I/R损伤期间LTC4生成的机制，作者检测了IP对I/R损伤肝脏LTC4S的表达和定位分布的影响。结果显示，肝脏再灌注5 h后，I/R组，而不是IP处理组大鼠肝LTC4S蛋白表达较未处理组明显增加； IP组LTC4S蛋白表达与I/R组相比则显著下降。LTC4S在I/R组大鼠肝脏中血管内皮细胞和肝细胞有较强的阳性表达，但在IP组，大鼠肝脏血管内皮细胞和肝细胞中仅显示轻微LTC4S染色阳性。这些结果表明，IP减少LTC4生成可能涉及其下调大鼠I / R损伤肝脏中LTC4S蛋白表达。

LTC4合成酶(LTC4S，mGST2和mGST3)都能共轭结合LTA4和GSH生成LTC4，其mRNA和蛋白质在大鼠肝脏均有表达。本研究曾报道，肝脏I /R期间LTC4堆积可能部分由LTC4合成酶活性增加造成，其中，主要是由于LTC4S所致[2]。有理由设想IP降低LTC4生成，也可能与其改变LTC4合成酶的活性有关。本研究证实，IP显著降低肝I/R损伤大鼠肝微粒部分LTC4合成酶的活性，表明IP降低LTC4的形成可能与其在I/R过程中抑制肝LTC4合成酶的活性有关。

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2013- 09- 04

2013- 11- 25

国家自然科学基金(81260504)；江西省教育厅科研基金(GJJ12073)

*通信作者(correspondingauthor)： slyang@ncu.edu.cn

1001-6325(2014)08-1098-03

R 363

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