同位素稀释法测定乳制品中的残留氯霉素

唐吉旺，周 丛，林 源，肖 泳，钟文涛，吴海智

（湖南省产品商品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410007）

氯霉素是一种广谱性抗生素，在所有成年动物中作为兽药被长期使用.兽医临床上用于治疗畜禽的细菌性疾病.食品中氯霉素残留对人类的健康构成直接或潜在的威胁，特别是氯霉素能导致人类的再生性障碍性贫血，是一种可能的致癌物质，并且其致癌效果与剂量大小无关.因此，欧盟、美国、加拿大规定氯霉素严格禁止在食用动物中使用，同时欧盟实施愈来愈严格的计划监控，规定氯霉素在肉、海鲜、鸡蛋、牛奶、蜂蜜等食用动物内的最小执行限量（MRPL）为0.3μg/kg.因此，寻求快速、灵敏检测技术，降低方法的检出限成为氯霉素残留检测技术研究焦点［1-4］.

由于样品本身具有复杂的基质，再加上最低检测限量（＜0.3μg/kg）和检测方法可行性这双重严格标准，氯霉素食物残留分析具有很大的挑战性.高效液相色谱串联质谱检测技术，推进了液相色谱的发展，其具有特异性和灵敏性，非常适合食物中氯霉素残留的分析.LC-MS/MS运行之前需进行样品制备和前处理.而传统的前处理过程中用到固相萃取（SPE）和液-液萃取（LLE）技术［5-7］，样品前处理比较费时费力，同时增加了检测成本.本文作者介绍一种简单样品制备方法，该方法仅仅使用乙腈进行氯霉素的提取，同时进行蛋白质沉淀，将沉淀物分离后即可进行高效液相分离和三重四级杆质谱仪的检测.此样品前处理方法简单、快速、费用低，同时满足定性分析特异性需求和定量分析的灵敏度要求.其有效性也符合欧盟规定2002/657/EC.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱-串联质谱仪（TSQ Quantum Ultra Thermo Fisher Scientific），配有电喷雾离子源；台式高速冷冻离心机（Neofuge 23R，上海力申科学仪器有限公司）；10mL聚四氟乙烯离心管；超声仪（SB-5200DT，宁波新芝生物科技股份有限公司）.

氯霉素（CAP）：纯度≥99.0%；氯霉素氘代内标（CAP-D5）：纯度≥99.9%；乙腈，液相色谱纯.

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取10.0mg氯霉素和氯霉素-D5，用乙腈定容至100mL，配制成100.0mg/L的标准储备液，使用时根据需要用水稀释成相应浓度的标准品溶液.

1.3 样品前处理

准确秤取2.0g液体乳制品或1.0g固体乳粉（固体乳粉在处理前需加2mL的40～60℃的热水将其溶解），加入400μL浓度为100μg/L的氯霉素-D5溶液，涡旋混匀，再加入3mL乙腈，涡旋振荡提取1～2 min后，于超声仪中超声30min.超声提取后，4℃条件下以6 000r/min冷冻离心10min.取上清液0.75 mL，加入0.25mL水，涡旋混匀，并于4℃冰箱中储存1h.再以6 000r/min冷冻离心10min.取上清液，用0.22μm的有机膜过滤，然后进行HPLC-MS/MS测定.

1.4 HPLC-MS/MS条件

1.4.1 HPLC条件

色谱柱：Hypersil GOLDTM柱（100mm×3mm，1.9μm）；流动相：溶剂A为水，溶剂B为甲醇；梯度洗脱程序：0～0.5min，80%A，0.5～3.5min，80%A～5%A，3.5～3.9min，5%A，3.9～4.0min，5%A～80%A，4～5.0min，80%A.流速为0.5mL/min，柱温为35℃，进样量为10μL.

1.4.2 MS/MS条件

离子源为电喷雾电离离子源（ESI），扫描方式为负离子扫描，辅助气压力为10Arb，鞘气压力为45Arb，离子喷雾电压（IS）为2 800V，雾化器温度为300℃，离子源温度为350℃，碰撞气（氩气）压力为1.5mtorr，检测方式为选择离子监测（SRM）扫描模式.

2 结果与讨论

2.1 样品前处理条件的优化

由于乳制品样品基质复杂，含有较高浓度的蛋白质及大量的内源性化合物，干扰目标物的测定，因此必须尽量去除蛋白质，减少基质对测试的影响.此实验方法的主要目的就是为了避免使用许多文献中提到的费时费力的固相萃取（SPE）或是液-液萃取（LLE）制备方法.氯霉素易溶于乙腈，因此选用乙腈作为提取溶剂，可以对目标化合物进行有效的提取，同时乙腈又能较好地沉淀蛋白质.实验结果表明，当乙腈与样品溶液的体积比为1.5∶1时，能满足提取效率的要求，达到富集的目的，同时能初步沉淀蛋白质.取部分乙腈提取液，按照一定的比例加水稀释，这步操作对梯度色谱分离来说是非常必要的.实验表明，乙腈提取液和水的比例为3∶1时，蛋白质沉淀效果比较好，但是蛋白质的清除是不彻底的.当在4℃的冰箱中放置1h后，试管底部出现蛋白质沉淀的痕迹，因此这步操作可以防止未沉淀彻底的蛋白质进入仪器，干扰分析，污染仪器.

2.2 色谱条件的优化

分别考察了甲醇-水和乙腈-水流动相系统对于目标化合物峰型和离子化效率的影响.结果表明用甲醇-水溶液作流动相，在梯度洗脱条件下，HPLC-MS/MS分析的色谱峰分离度较好，峰形好且响应高.因乳制品内源性干扰较多，不宜选用过短的色谱柱，兼顾分析耗时选择色谱柱长为100mm较为合适.

2.3 质谱条件的优化

在ESI负离子扫描模式下，对1mg/L的氯霉素和氯霉素-D5标准溶液进行全扫描.结果表明，这两种化合物的最强峰均为其准分子离子峰，因此选择分子离子［M-H］-为母离子.然后分别对准分子离子进行子离子扫描，得到碎片的离子信息，找到强度较大的三个子离子，并优化碰撞能量使其强度最大，将其中一个信号大的子离子作为定量离子，由此得到氯霉素和氯霉素-D5在负离子模式下的质谱分析参数见表1.所测定标准溶液中氯霉素及其同位素内标氯霉素-D5的SRM色谱图见图1.

图1 氯霉素和氯霉素-D5的SRM色谱图Fig.1 SRM chromatograms of CAP and CAP-D5

表1 氯霉素和氯霉素-D5质谱采集参数Table 1 MS/MS acquisition parameters for CAP and CAP-D5

2.4 标准曲线、线性范围与检出限

本方法采用内标法定量.在上述最佳色谱条件下，检测浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg/L的氯霉素标准工作液，以各浓度峰面积Y对相应浓度X绘制标准曲线，得到氯霉素的线性回归方程为Y＝0.010 64 X＋0.000 673 2，其相关系数R为0.999 8；以信噪比S/N＝3计算出样品中氯霉素的检出限LOD值为0.1μg/kg.结果表明在0.10～10.0μg/L范围内，浓度与峰面积有良好的线性关系.

2.5 方法的回收率和精密度

分别准确称取空白液体乳样品或奶粉样品，并分别添加3个水平的标准溶液，添加水平为0.2、2.0和10.0μg/L，按照前述步骤进行氯霉素的提取、超高效液相色谱-串联质谱法测定，每个添加水平平行测定6次.加标样品的SRM色谱图见图2.平均回收率和相对标准偏差（RSD）见表2.结果表明，氯霉素在液体乳基质中的回收率在95.0%～102.5%之间，相对标准偏差（RSD）在1.86%～5.35%之间；氯霉素在奶粉基质中的回收率在90.0%～101.0%之间，相对标准偏差（RSD）在2.16%～5.64%之间.

图2 乳制品空白及空白加标（加标量为2.0μg/L）SRM图Fig.2 SRM chromatograms of CAP in blank sample and blank samle spiked with 2.0μg/L of CAP

表2 氯霉素在液体乳和奶粉中的加标回收率及其精密度（n＝6）Table 2 Recoveries and precisions of CAP spiked in liquid milk and powdered milk（n＝6）

2.6 实际样品检测

分别对湖南、贵州及武汉三个省份奶制品中的氯霉素进行了监测，共计65个样品，其中奶粉为18个样，其余均为液体乳及其制品，监测结果为均未检出氯霉素残留.这表明目前乳制品奶源中的兽药残留得到了较好的控制.

结论：本文建立了同位素稀释的HPLC-MS/MS法检测乳制品氯霉素残留的方法，样品前处理简捷方便、处理过程所用有机试剂少、可操作性强，分析成本低，分析效率高，便于大批量的样品分析；同时，质谱分析时间短，方法的检测限低，准确度和精密度均达到了药物残留分析的要求，为监测乳制品质量安全提供了一种较好的检测手段.

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