利用正交设计优选NR2A的Western Blot成像条件

高岚岳，苑 洁，姜 泓

（中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110001）

Western Blot中文称为蛋白质印迹法，是蛋白质分析的最流行的技术之一，现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等方面.Western Blot测定结果采用目的蛋白的灰度值计算法，在自动曝光成像过程中，常由于背景干扰大的原因，而出现测量结果不准确及测定结果重现性差等问题.为保证良好的成像质量及准确度、重现性好的条带灰度值，有必要对成像条件进行优化，以确保Western Blot结果的准确性.

NR2A是兴奋性氨基酸谷氨酸的特异性受体（NMDA受体）的调节亚单位之一，具有调制突触传递、触发突触可塑性以及参与学习与记忆等重要的生理功能［1-2］.在前期研究中，作者通过调整蛋白上样量、电泳和转膜条件、封闭时间、一抗和二抗稀释倍数用以增强杂交信号、降低背景.但采用自动曝光的凝胶成像系统，NR2A成像结果仍然不理想，所以本研究采用手动曝光的凝胶成像系统，以双指标（条带灰度值和背景灰度值）进行综合评价优化NR2A的成像条件，以期得到理想的成像结果.

本研究以NR2A为切入点，研究其最佳成像条件，采用正交实验法，对影响条带灰度值和背景灰度值的因素如光圈（A）、焦距（B）、曝光时间（C）等进行考查；探讨NR2A的Western Blot最佳手动成像条件，以期为采用该技术的应用提供依据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

BCA试剂盒（全士金公司）、山羊抗NR2A抗体（SANTA公司）、山羊抗β-actin抗体（SANTA公司）、ECL显影试剂盒（全士金公司）.

超声波细胞粉碎机（宁波科生仪器厂）、3K18型超速低温离心机（美国Sigma公司）、水平及垂直摇床（海门市麒麟医用仪器厂）、蛋白质电泳装置（TANON公司）、蛋白质电转印装置（TANON公司）、Gel Logic 2200型成像系统（KODAK公司）、Gel-Pro analyzer4图像分析软件.

1.2 组织蛋白的提取及浓度测定

取50mg大鼠脑海马置于2mL EP管中，用干净的剪刀将组织块剪碎，加入450μL细胞裂解液进行裂解，然后置于冰上；用超声波细胞粉碎机超声60s后再置于冰上，重复3次使细胞破碎；4℃下12 000r/min离心15min×2次，取上清液，分装于新离心管中；采用BCA试剂盒法测定上清液中蛋白浓度，并调整蛋白浓度至3g/L.

1.3 蛋白的分离与含量测定

采用Western Blot法进行蛋白含量分析.每孔道加15uL蛋白样品，依次经聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜（采用PVDF膜），TBS-T洗膜，脱脂奶粉封闭，TBS-T洗膜，4℃下一抗（NR2A1∶1 000，β-actin 1∶3 000）孵育过夜，TBS-T洗膜，二抗（兔抗山羊1∶3 000）孵育2h，TBS-T洗膜，ECL法显色.用成像系统采集图像，重复3次，利用图像分析软件测量蛋白条带和背景的灰度值.

1.4 正交实验优选成像条件与实验安排

以条带和背景的灰度值为考查指标，以光圈（A）、焦距（B）、曝光时间（C）作为3个因素，因素水平见表1.采用L9（34）正交设计表安排实验.

表1 成像的因素水平Table 1 The factor level of imaging

1.5 数据处理

采用SPSS 16.0软件对所测数据进行统计分析，数据用均数±标准差（¯x±s）表示，采用正交设计方差分析进行比较，各因素内各水平进行多重比较，检验水准P＜0.05.

2 结果与讨论

2.1 成像条件的选择

如前所述，Western Blot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，用于研究目的蛋白的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋白的相互作用.Western Blot具有电泳技术分辨力强、免疫反应特异性强和免疫标记技术灵敏度高的特点，是一种便捷、可靠的实验方法.Western Blot实验结果要求所得图片清晰，即杂交信号强、背景低，测定的目的蛋白灰度值准确、重现性好.在实验过程中，除通过调整封闭时间、膜的处理、一抗和二抗稀释倍数降低非特异性结合背景外，还需要通过调整成像效果排除背景色干扰，这是Western Blot实验的最后、最关键的一步.

光圈、焦距和曝光时间是影响成像效果的三个主要因素.光圈和曝光时间调节明暗，焦距调节清晰度.光圈是用来控制光线透过镜头，进入机身内感光面光量的装置.光圈大小用F值表示，F值愈小，通光孔径越大，在同一单位时间内的进光量便越多，例如光圈从F8调整到F5.6，进光量便多一倍.此外，上一级的进光量是下一级的一倍，所以光圈F值越小，图像越亮，反之越暗.本实验光圈的F值范围是1.2～16mm.前期实验证明光圈为2～4mm时，灰度值无显著差异（P＞0.05），所以本实验对光圈范围（4mm≤F≤8mm）进行研究.曝光时间是为了将光投射到照相感光材料的感光面上，快门所要打开的时间，主要指CCD成像平面的感光时间.曝光时间越长，进光量便越多，拍摄的图像越亮，反之图像越暗.前期实验证明曝光时间为60～120s时，灰度值无显著差异（P＞0.05）.考虑到工作效率问题，选定曝光时间在60s内进行研究.焦距指平行光入射时透镜光心到光聚集之焦点的距离，亦是从照相机镜片中心到CCD成像平面的距离.本实验焦距的范围是2.5～30mm.除以上三个因素外，视场（ZOOM＝30%）、像素合并（binning＝4＊）均为固定值.

NR2A是NMDA受体的亚单位之一，在脑内分布广泛，以海马、皮层和小脑最丰富，具有调制突触传递、触发突触可塑性以及参与学习与记忆等重要的生理功能［3-4］.已有研究发现，在突触后致密体（PSD）中，NMDA受体中NR2A蛋白质C末端由于受到钙/钙调素依赖的蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）同突触后致密体95（PSD-95）之间竞争性地结合从而影响海马的突触可塑性［5］.决定受体的电生理学和药理学特性［6-7］.实验过程中，我们采用凝胶成像系统自动曝光，未得到理想的NR2A成像结果，所以本研究采用具有均衡分散、综合可比及可伸缩、效应明确等特性的正交实验设计法，以便最快的找到最优的水平组合［8-9］.

2.2 正交实验结果

目前关于Western Blot成像条件的优化研究未见报道，本实验以NR2A为切入点，以条带灰度值和背景灰度值为考查指标进行研究.按实验部分1.2、1.3进行操作，测量条带和背景的灰度值，并进行方差分析，结果见表2和表3.

表2 成像的因素水平L9（34）正交实验表Table 2 L9（34）orthogonal design table for the factor level of imaging

表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis

从表2和表3的结果分析上可以看出，三个因素的影响大小依次为A＞C＞B，且A1＞A2＞A3，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，A因素和C因素的影响具有显著性.综合分析各个因素对条带和背景灰度值的影响，确定最佳成像条件：光圈为4mm、焦距为30mm、曝光时间为60s.

2.3 验证实验

为了验证所选条件的合理性，进行了三次验证实验，从表4结果可知，所选成像条件较稳定，故确定最佳成像条件：光圈为4mm、焦距为30mm、曝光时间为60s.采集图像如图1所示.

表4 三次验证实验结果Table 4 Results of three verification tests

图1 三次验证实验图像Fig.1 Images of three verification tests

3 结论

采用正交设计的方法得到NR2A的Western Blot最佳成像条件：光圈为4mm、焦距为30mm、曝光时间为60s.

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