不同时间电针刺激对大鼠脊髓损伤后磁共振弥散张量纤维束成像部分各向异性值均值的影响

高连军，孙迎春，李建军，白帆，李鹏锟

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是中枢神经系统的一种严重创伤。最新的流行病学数据显示，亚洲人脊髓损伤发病率已从12.06/100万上升到61.6/100万，平均年龄从26.8岁上升到56.6岁，并且有逐年上升的趋势[1]。

脊髓损伤修复的研究已成为目前康复研究的重点。但迄今为止，还未出现有效的临床治疗方法。1994年，Basser等首次在传统的磁共振成像中应用弥散张量成像(diffusion tensor imaging,DTI)[2-3]。DTI通过测量组织的部分各向异性值(fractional anisotropy,FA)，可在三维空间内定量分析组织水分子的弥散能力[4-5]，是一项可以在体研究中枢神经白质纤维结构的新技术[6]，较磁共振弥散加权成像(diffusion weighted imaging,DWI)更能准确地反映组织内水分子的弥散情况，可以清楚显示脑与脊髓的细微病理生理变化以及白质纤维束的走行、连接和细微变化[7]。利用DTI所获得的数据进行大脑或者脊髓白质纤维束成像，即为弥散张量纤维束成像(diffusion tensor tractography,DTT)[4]。

电针刺激对受损脊髓修复有正向促进作用[8]。孙迎春等对电针刺激脊髓损伤大鼠的研究发现，头针加体针治疗组的Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分优于单纯头针或单纯体针治疗组，尤其是从第4周开始，头针加体针治疗组的BBB评分明显增高[9]。截止目前，国内外关于电针治疗对脊髓损伤后大鼠DTT影响的研究很少，并且没有相关脊髓损伤后电针介入治疗时间的研究。本研究欲探讨不同时间进行电针刺激治疗对促进脊髓神经修复的效果及其对DTT中FA均值的影响，探讨DTI及DTT技术在评估脊髓损伤大鼠神经修复中的临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

90只健康清洁级Sprague-Dawley大鼠，雌雄各半，体质量(220±20)g(中国人民解放军军事医学科学院动物实验中心)。

造模成功后，用随机数字表法将90只大鼠分为实验组(n=60)和对照组(n=30)，实验组又分为实验1组(n=30)和实验2组(n=30)。本篇论文所用数据是实验中的部分数据(n=16)。

1.2 模型制备

大鼠腹腔内注射2%戊巴比妥钠35 mg/kg，待麻醉生效后，手术区备皮，消毒，以T10为中心切开皮肤及皮下组织，暴露T9、T10棘突及椎板，咬除T9～T10棘突、T10椎板，运用NYU打击器以25 g·cm势能(10 g×25 mm)撞击脊髓，撞击后迅速移开撞击杆。此时大鼠双侧后肢及尾部痉挛性抽搐数次后软瘫。用生理盐水冲洗后在受损的脊髓上放一小块脂肪组织，逐层缝合。切口消毒，立即在背部皮下注射青霉素注射液4×105U和生理盐水20 ml，连续注射3 d。注射后将大鼠置于保温箱内24 h后转入单笼饲养。术后每天进行4次人工排尿，直至自主排尿建立。

1.3 干预方法

实验组接受头针和体针电刺激。实验1组3 d时开始电针刺激，实验2组2周时开始电针刺激。对照组不进行任何干预。

1.3.1 头针 取穴：运动区头皮表面投影区上2/5(顶骨正中斜刺向耳前方)。

将大鼠置于固定器内，待大鼠安静20 min后，针刺运动区头皮表面投影区上2/5，设定捻针仪每分钟捻转200转；每次捻针3 min。接通电针治疗仪，正极和负极接运动区左右针尾，选疏密波2 Hz，刺激强度以大鼠后肢轻微颤动为度，每次通电20 min。每天1次，共10次。

1.3.2 体针 取穴：双侧肝俞穴(T9下两旁肋间)、脾俞穴(T12下两旁肋间)、环跳穴(后肢髋关节后上缘)、后三里穴(膝关节后外侧，在腓骨小头下5 mm处)。

将大鼠置于固定器内，待大鼠安静20 min后，针刺双侧肝俞穴、脾俞穴、环跳穴、后三里穴，设定捻针仪每分钟捻转200转；每次捻针3 min。接通电针治疗仪，正极接肝俞穴，负极接脾俞穴，正极接环跳穴，负极接后三里穴，选疏密波2 Hz，刺激强度以大鼠后肢轻微颤动为度，每次通电20 min。每天1次，共10次。

1.4 BBB评分

在安静的环境，将大鼠置于2×2×0.5 m的BBB评定装置里，在4 min内观察记录动物后肢的行走及肢体活动情况。

评分包括3个部分：第一部分评判动物后肢各关节运动及活动度；第二部分评判后肢的步态及前后肢协调功能；第三部分评判运动中足、趾及尾巴的精细动作。满分为21分[10]。

本实验由对分组情况不知情的专门评价人员对各组实验大鼠进行评价。分别于SCI后1、2、4周分别由两名专门评价人员按照BBB评分法[10]评分标准对大鼠后肢运动功能进行独立评分，左右侧下肢评分不相同时分别记录获取数值，每只大鼠的功能得分取两人评分均值。

1.5 DTT/DTI扫描

采用Bruker ClinScan 7.0 T超导型磁共振扫描系统(西门子公司)。实验组和对照组分别于造模后2～4 h、术后3 d和治疗后4周进行矢状面和横断面T2WI成像及横轴面DTI成像。DTI检查与常规横轴面扫描定位相同。DTI扫描采用单次激发自旋回波平面回波成像序列(echo-planar imaging,EPI)，TR 5000 ms，TE 35 ms，显示野36×30，扫描时间225 s，层厚0.8 mm，弥散加权系数b值600 s/mm2，弥散敏感梯度20个方向，扫描2次，层距为层厚的30%，矩阵128×128，层数覆盖损伤区域。数据处理利用syngoMRB15图像后处理软件(西门子公司)。

由动物核磁室专业医师(非实验组人员)按照实验要求对每只实验鼠进行DTI和DTT扫描，获取数据，并进行图像处理。由统计人员按照实验要求进行数据统计。

1.6 统计学分析

采用SAS 9.2统计软件对实验数据进行处理和统计学分析。所有的测量结果均以表示，BBB评分和FA均值各组不同时间点观测的结果均用单因素方差分析，两两比较用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠后肢BBB评分

实验组和对照组在第1周时各组间BBB评分无显著性差异(P>0.05)。第4周时实验组BBB评分显著高于对照组(P<0.001)。在第2周和第4周，实验1组显著高于实验2组(P<0.001)。见表1。

表1 各组大鼠后肢运动神经功能BBB评分

2.2 大鼠对应脊髓节段FA均值

本实验所得FA信号均值(FA均值)与FA值呈正相关，并可以反映FA值的变化。在2～4 h和3 d时各组FA均值无显著性差异(P>0.05)。在第4周时，实验1组和实验2组显著高于对照组(P<0.001)，且实验1组高于实验2组(P<0.05)。见表2。

表2 各不同组间大鼠对应脊髓节段FA均值比较

2.3 在相同时间节点对应脊髓节段DTT

图1～图6是分别代表各组伤后2～4 h和4周的DTT。图中的颜色代表特征向量运动方向的变化。具体如下：蓝色代表上下方向，红色代表左右方向，绿色代表前后方向[11]。从图中可以看出在脊髓损伤后2～4 h内，因为脊髓纤维束的断裂导致脊髓纤维束内各个方向的分子弥散运动而呈现出不均匀的红色和绿色，提示大鼠脊髓纤维束的损伤。

从后视(P位)图中可以看到：各组第4周的脊髓纤维束较伤后均有不同程度的修复，其中实验组较对照组明显好转(白箭头)。体现在：①脊髓纤维束神经纤维数目增多；②脊髓纤维束均质性变好(水分子在脊髓纤维束上下运动呈现出均匀蓝色)。

图1 实验1组伤后2～4 h的DTT

图2 实验1组伤后4周的DTT

图3 实验2组伤后2～4 h的DTT

图4 实验2组伤后4周的DTT

图5 对照组伤后2～4 h的DTT

图6 对照组伤后4周的DTT

3 讨论

脊髓损伤后，尽可能减少早期病理损害，降低继发损伤，提高残留神经纤维存活是减轻和治疗脊髓损伤的关键。而受损神经元的修复和再生与神经纤维的生存微环境等多种因素相关。有研究报道，电针刺激能够促进神经生长活性物质的表达与神经的再生与修复，但其机制仍需进一步的研究[12]。

实验组和对照组在第1周时各组间BBB评分无显著性差异，说明脊髓损伤后1周内针灸治疗对运动神经功能恢复无明显影响。这与其他研究一致。分析这可能与早期脊髓损伤后大鼠脊髓水肿炎症持续存在有关[13]。

电针后，各实验组BBB评分显著高于对照组(P<0.001)，说明各种电刺激(针灸)对运动神经功能恢复在2周后能够出现改善，并且随着时间延长，有积极的治疗作用。推测其机理可能与针刺能明显地减轻和延缓伤后早期病理损害，扩张血管，改善血管舒缩功能，并且在缺血或再灌期间能进一步上调活性生长因子的免疫活性表达[14]，使组织间神经纤维间的水肿减轻、神经保护活性因子表达增强等相关。

在相同时间节点(第2周和第4周)，实验1组BBB评分显著高于实验2组(P<0.001)。提示电针刺激对运动神经功能恢复越早期开始治疗，效果越明显。有研究发现，电针治疗急性脊髓损伤大鼠的最佳治疗时间为损伤后2 h，并认为脊髓损伤后，电针治疗应及早介入[15]。这与本实验所得结论一致。

弥散(diffusion)是指分子的随机不规则运动，又称布朗运动(Brownian motion)。FA反映分子在空间位移的程度，且与组织的方向有关，是水分子各向异性成分占整个弥散张量的比例。其变化范围为0～1[5]。虽然反映各向异性的参数有很多，但目前临床上，应用较多的是FA值。但是FA值也有其临床局限性，体现在以下方面：①当各本征值同比例改变的时候，FA保持不变；②FA值测量具有部位敏感性[16]。

本实验所得FA均值与FA值呈正相关，并可以反映FA值的变化。在2～4 h和3 d时间点各组FA均值无显著性差异(P>0.05)。第4周时，实验组显著高于对照组(P<0.001)，而且实验1组高于实验2组(P<0.05)。从FA均值变化趋势可以看出，FA值的变化也呈现出一个先升高后下降的过程。

脊髓损伤初发时FA值增高，可能与细胞毒性水肿、髓鞘纤维肿胀导致细胞膜通透性减低、细胞外间隙迂曲减小有关。之后，FA值降低，则与结构破坏导致脊髓纤维组织的完整性及方向性丧失、血管源性水肿致细胞外间隙扩大、局部细胞外水肿和/或纤维束中断、减少有关[17]。研究发现，髓鞘和神经纤维撕裂、细胞外水肿导致Wallerian变性、脱髓鞘改变可能使FA值减低[18]。

在第4周时间点上各组之间有显著性差异，实验1组、实验2组FA均值显著高于对照组(P<0.001)，提示针灸在一定程度上减少了脊髓损伤后各种病理改变；实验1组较实验2组FA均值也有提高(P<0.05)，说明早期介入针灸治疗可以最大化的减少脊髓损伤后的继发损伤。本实验证实，伤后FA均值因为继发损伤、脱髓鞘改变而降低，针灸在一定程度上减缓此过程，并且早期介入针灸治疗，恢复效果好。本实验在一定程度上可以认为FA均值可以替代FA值来评价大鼠脊髓损伤的修复程度，并且可较敏感地反映脊髓神经修复的变化。

由于DTT是近年来在DWI基础上迅速发展起来的磁共振成像新技术，其名称尚欠统一。例如有称为纤维跟踪技术(fiber tracking)[4]或白质纤维束成像(tractography)[19]等。脊髓纤维束弥散张量成像的原理是利用主要特征向量的数据映射为颜色而成图。一般用颜色来表示纤维束走形方向的变化：蓝色代表上下方向，红色代表左右方向，绿色代表前后方向[11]。

本实验中利用这一原理合成DTT。在脊髓受损伤后，因为纤维束的断裂导致纤维束走形方向的改变，DTT根据分子沿着断裂脊髓纤维束的不同方向进行弥散运动而呈现出不同颜色的改变，从而在成像上清晰地显示出脊髓纤维束的损伤情况。脊髓纤维束的修复体现在以下方面：①脊髓纤维束神经纤维数目增多；②脊髓纤维束均质性变好(水分子在脊髓纤维束上下运动呈现出均匀蓝色)。

本实验中无论实验组还是对照组，4周后DTT都显示出纤维束有不同程度的修复，而且实验组修复程度明显好于对照组。4周后实验1组和实验2组DTT虽然提示纤维束走形和密度都好于损伤后2～4 h，但是并不能显示出修复程度上的明显区别。分析原因可能与以下方面相关：①由于临近组织的影响以及DTI对磁场不均匀高度敏感[20]等原因，重建的脊髓纤维束图像长短粗细不均，且无法显示全长图像；②我们选取的是P位图即后视图，在一定程度上增加了分析的难度。

本研究是应用于大鼠脊髓损伤DTT的前期研究，有很多局限和不足，期待随后的研究能对在DTT成像参数和评估纤维束修复程度上有所改进。

虽然本研究是国内DTI与DTT技术应用与评价大鼠脊髓损伤模型的前期探索，已显示出其独特的效果和优越的价值，为下一步的大鼠脊髓损伤基础实验研究中的神经修复功能评价上提供更重要的参考价值。

4 小结

本实验结果显示，头体针电刺激对脊髓损伤后神经轴突再生或修复的影响显著。并探索性地研究了电针刺激介入的时间，用FA均值的改变来描述和分析脊髓损伤后神经修复情况。从本实验涉及的不同时间进行电针刺激治疗的结果显示，伤后电针3 d时的治疗效果显著好于2周时的治疗效果，提示在临床治疗中针灸治疗早期介入效果好。

由于入组大鼠和时间点选取较少，可能会对实验结果有一定的影响，有待后期更早期并更密集时间点的大型实验研究。

DTT是一种评估脊髓损伤大鼠模型的新型无创影像学手段。本实验用其验证了FA均值在临床和基础研究应用中的意义，但是DTT也有一定的局限性。DTT技术的应用对脊髓损伤大鼠模型神经纤维束的修复提供了更直观的参考数据(FA均值)，为实验动物的观察提供很好的方法。

电针刺激对促进神经再生与修复的作用是显著的，对脊髓损伤的治疗作用是积极的，而且早期介入效果好。对脊髓损伤大鼠模型电针最佳的介入治疗时间仍有待研究发现。

[1]Ning GZ,Wu Q,Li YL,et al.Epidemiology of traumatic spinal cord injury in Asia:a systematic review[J].J Spinal Cord Med,2012,35(4):229-239.

[2]Basser PJ,Mattiello J,LeBihan D.Estimation of the effective self-diffusion tensor from the NMR spin echo[J].JMagn Reson B,1994,103(3):247-254.

[3]Basser PJ,Mattiello J,LeBihan D.MR diffusion tensor spectroscopy and imaging[J].Biophys J,1994,66(1):259-267.

[4]Mori S,van Zijl P.Fiber tracking:principles and strategies–a technical review[J].NMRBiomed,2002,15(7-8):468-480.

[5]Yoo WK,Kim TH,Hai DM,et al.Correlation of magnetic resonance diffusion tensor imaging and clinical findings of cervical myelopathy[J].Spine J,2013,13(8):867-876.

[6]Stieltjes B,Kaufmann WE,van Zijl P,et al.Diffusion tensor imaging and axonal tracking in the human brain stem[J].Neuroimage,2001,14(3):723-735.

[7]Danielian LE,Iwata NK,Thomasson DM,et al.Reliability of fiber tracking measurements in diffusion tensor imaging for longitudinal study[J].Neuroimage,2010,49(2):1572-1580.

[8]孙迎春,李建军,高莉敏,等.不同穴位电针对大鼠脊髓损伤植入脐血干细胞后生长相关蛋白-43、髓磷脂碱性蛋白表达的影响[J].中国康复理论与实践,2009,15(6):524-528.

[9]高莉敏,孙迎春.析因设计在针灸治疗脊髓损伤康复研究中的应用[J].中国康复理论与实践,2009,15(10):942-944.

[10]Basso DM,Beattie MS,Bresnahan JC.A sensitive and reliable locomotor rating scale for open field testing in rats[J].J Neurotrauma,1995,12(1):1-21.

[11]O'Donnell LJ,Westin CF.An introduction to diffusion tensor image analysis[J].Neurosurg Clin N Am,2011,22(2):185-196.

[12]孙迎春,李建军,高莉敏,等.电针刺激对脊髓损伤大鼠植入脐血干细胞后生长相关蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子表达的影响[J].中国康复理论与实践,2009,15(8):717-719.

[13]郝春光,刘佳,杨霄彦,等.电针刺治疗对脊髓全横断损伤大鼠后肢运动功能的影响[J].解剖与临床,2008,13(1):30-32.

[14]Stoner L,Sabatier MJ,Mahoney ET,et al.Electrical stimulation-evoked resistance exercise therapy improves arterial health after chronic spinal cord injury[J].Spinal Cord,2007,45(1):49-56.

[15]王婷婷.电针不同介入时间对急性脊髓损伤大鼠NO、MDA和SOD影响的实验研究[D].北京:北京中医药大学,2009.

[16]Löbel U,Sedlacik J,Güllmar D,et al.Diffusion tensor imaging:the normal evolution of ADC,RA,FA,and eigenvalues studied in multiple anatomical regions of the brain[J].Neuroradiology,2009,51(4):253-263.

[17]Renoux J,Facon D,Fillard P,et al.MR diffusion tensor imaging and fiber tracking in inflammatory diseases of the spinal cord[J].Am JNeuroradiol,2006,27(9):1947-1951.

[18]Nevo U,Hauben E,Yoles E,et al.Diffusion anisotropy MRI for quantitative assessment of recovery in injured rat spinal cord[J].Magn Reson Med,2001,45(1):1-9.

[19]Basser PJ,Pajevic S,Pierpaoli C,et al.In vivo fiber tractography using DT-MRI data[J].Magn Reson Med,2000,44(4):625-632.

[20]苏晋生,代卫斌,武瑞凤,等.DTI对脊髓圆锥与终丝界限区分的初步研究[J].实用医学影像杂志,2006,6(5):250-252.