等离子技术在弗氏链霉菌和侧耳属诱变选育中的应用

王忠中，张 萍，石彦鹏

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川750101)

抗生素发酵生产中，菌种的发酵水平是提高产能的至关重要的因素，而菌种的发酵水平可通过大量的筛选、诱变、基因工程手段进行提高［1］。所以，各生产企业、研究机构都在菌种筛选诱变方面进行大量的研究和开发，并取得很好的效果。越来越多的技术被应用到菌种选育当中［2］。但传统的方法由于多次重复使用导致诱变效果不明显，而一些新技术条件苛刻、费用昂贵，很难在工业生产中普及。

常压室温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma，简称ARTP)是近几年来发展起来的一种等离子体源，能够在大气压下产生温度在25～40℃之间的、具有高活性粒子(包括处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等)浓度的等离子体射流［3］。科学研究表明，等离子体中的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞表面电势下降;改变细胞壁/膜的结构及通透性;能够对菌株/植株/细胞等的遗传物质造成损伤，并诱发生物细胞启动SOS修复机制，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变，已在生物诱变中广泛应用［4－5］。

本文利用氦气源ARTP分别对弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)和侧耳属(Pleurotus sp.)进行了不同时间的照射，统计死亡率，并对诱变后的菌株进行筛选，确定了ARTP对两种不同微生物的最佳照射时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 泰乐菌素产生菌弗氏链霉菌，编号12－662，斜面孢子;泰妙菌素生产菌侧耳属，编号12－142，斜面菌丝。两菌种由宁夏泰瑞制药股份有限公司种子室保存。

1.1.2 主要设备 室温常压等离子体诱变系统(ARTP)，北京思清源生物科技有限公司;旋转摇瓶机，XDW25/96型，四川长征制药机械厂;紫外可见分光光度计，UV1800、高效;液相色谱仪，日本岛津公司;恒温、净化工作系统。

1.1.3 试剂及原料

1.1.3.1 氦气，纯度 99.99%;麸皮，自制;葡萄糖、氯化钴、磷酸氢二铵、硫酸镍、硫酸锌、氯化镁等均为分析纯，鱼蛋白胨、酵母膏为北京奥博星生物试剂公司;玉米浆、豆饼粉、鱼粉、玉米粉、玉米蛋白粉为本地农副产品。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 将弗氏链霉菌斜面孢子用无菌水洗下摇匀，制备成孢子悬液。将侧耳属斜面菌丝铲下移入组织研磨器中，加入无菌水研磨均匀［6］。

1.2.2 照射菌膜制备 分别取制备好的菌悬液1滴，加到专用不锈钢片上，涂均匀，在无菌条件下干燥形成菌膜。

1.2.3 等离子诱变 开启ARTP诱变系统，调整氦气供气压力在0.1～0.2 MPa，设定入射气流为8.0 SLM，功率为140 W，将载有菌膜的钢片放入诱变系统操作室，调整至发射口正下方，距发射口2 mm，照射时间由20 s到400 s递增。由于弗氏链霉菌是用孢子悬液进行诱变，抵抗能力强，诱变时间从120 s开始，以30 s间距递增;侧耳属是菌丝片段进行诱变，抵抗力弱且不耐长时间干燥，诱变时间从20 s开始，以5 s间距递增。每组设两个钢片，将照射后的菌膜置同一试管制备菌悬液。同时以不照射的两个载有菌膜的钢片为对照组。

1.2.4 诱变菌株的分离与培养 将照射后的及对照组钢片分别置于灭菌试管中，加入1 mL无菌生理盐水剧烈震荡，洗下菌膜并摇匀，按10倍稀释法稀释至10－5倍，每个稀释度取0.1 mL涂布接种平板5个。置培养箱中按照宁夏泰瑞制药股份有限公司企业内控标准控制工艺培养形成单菌落［6－7］。

1.2.5 单菌落的挑取和死亡率计算 待单菌落培养好后，选择挑取典型形态的单菌落进行扩培和筛选，并对平板上的菌落进行计数。计算每组平均菌落数相对于对照组的死亡率。

1.2.6 摇瓶筛选 将扩培后的单菌落斜面挖块接入发酵瓶中进行摇瓶发酵初筛，同时以原诱变前斜面做对照，发酵结束测定发酵液效价，泰乐菌素发酵液用分光光度计法，泰妙菌素发酵液用高效液相色谱法。根据初筛结果挑选高效价菌株进行复筛，复筛采用二级发酵，即将斜面挖块接种到种子瓶培养基中，培养成熟后按10%接种量将种子液接入发酵瓶培养基中进行摇瓶发酵。每个单菌落斜面接1个种子瓶，每个种子瓶平行接3个发酵瓶，同时进行摇瓶发酵。

1.2.7 传代稳定性考察 经过复筛高于对照的菌株进行传代考察稳定性，每个菌株三代，分别用F0、F1、F2、F3表示原种、一代、二代、三代。每代斜面接1个种子瓶，每个种子瓶平行接5个发酵瓶，同时进行摇瓶发酵，以F0代效价为对照，考察各代斜面平均效价和均匀情况。

2 结果与分析

2.1 死亡率与照射时间的关系 结果见图1。

图1 死亡率与照射时间关系图

从图1可以看出，不同菌种对等离子的耐受情况明显不同，弗氏链霉菌在150 s以内死亡率不足30%，150 s以后死亡率迅速上升，270 s时达92.8%;而侧耳属在20 s时死亡率已达70%以上并随着照射时间的增加迅速上升，35 s达95%以上，40 s以后全部死亡。

2.2 诱变菌株初筛结果 两种菌在诱变后其菌落形态没有发生明显变化，而菌落大小与菌落多少有关，不能直接从菌落形态观察变异情况。分别从诱变后的平板中挑取100株菌落扩培成斜面进行初筛。弗氏链霉菌210 s以前各组平板中菌落比较密、比较小，无法挑取单个菌落，故未进行筛选。初筛结果统计如表1，相对效价见图2。

表1 诱变菌株的初筛结果统计

图2 初筛效价与照射时间关系图

从初筛结果看，高效价比例(正变率)较高的照射时间段其诱变死亡率并不是很高，集中在80%～90%，弗氏链霉菌和侧耳属两种菌基本接近，对应照射时间分别为240～270 s和25～30 s;同时在该照射时间段下，正突变菌株初筛效价高于对照的幅度较大，大多数超过5%，有明显趋势，说明等离子诱变中，死亡率太高反而不利于菌种正突变。

2.3 诱变株复筛结果 分别将初筛中高于对照的菌株接入发酵瓶进行摇瓶复筛，结果见表2和表3。

表2 弗氏链霉菌诱变株复筛效价结果 u/mL

表3 侧耳属诱变株复筛效价结果 u/mL

表2 结果显示，弗氏链霉菌270 s照射组选出的62号菌株复筛效价高于对照10.4%;表3结果显示，侧耳属25 s照射组选出的28号菌株复筛效价高于对照9.6%。

2.4 稳定性考察结果 分别将弗氏链霉菌62号菌株和侧耳属28号菌株传三代培养成斜面，接入发酵瓶进行稳定性考察，结果见表4。

表4 筛选株传代稳定性考察

表4 稳定性结果显示，弗氏链霉菌随着代次增加，发酵能力逐渐减低，F3代斜面效价低于 F0代4.9%，整体稳定性较好。侧耳属在F1代时，效价明显高于F0代，但到F2代后迅速降低，低于F0代，三代内最大差异3.9%。

3 讨论

3.1 从死亡率分析，不同菌种的耐受程度有较大区别，与菌种特性有关，弗氏链霉菌为放线菌，其孢子耐受能力强，而侧耳属为不产孢子担子菌，菌丝较脆弱，随着作用时间的延长，很快死亡。但利用ARTP诱变菌种，死亡率曲线相对较为平缓，有利于诱变功率和作用时间的掌握。

3.2 在制备菌膜时不可使用生理盐水，以免干燥后无机盐晶体析出，诱变时飞溅和导电。

3.3 该方法离子源能量稳定，诱变过程中温度维持在40℃以内，可有效防止菌种因高温死亡或部分对温度敏感的功能蛋白变性。

3.4 ARTP相对于其他物理化学诱变手段，主要优势体现在诱变过程不产生有毒有害废物，危险性小，诱变株培养不需要特殊防护［1］;与重离子束注入法相比，该方法操作简便，不需要大型粒子加速器装置，普通实验室即可开展［8］;也不需要航天育种那样受限制［9］，在生物育种方面有较好的应用前景。

本试验采用ARTP技术进行诱变，弗氏链霉菌诱菌株复筛效价高于对照的占复筛数的47%，最高效价高于对照10.4%;侧耳属复筛效价高于对照的占复筛数的33%，最高效价高于对照9.6%，表明该方法诱变菌种有较好的效果。试验最终确定弗氏链霉菌和侧耳属诱变的最佳照射时间分别为240～270 s和25～30 s。

［1］施巧琴，吴松刚.工业微生物育种学［M］.北京:科学出版社，2003.

［2］陈德刚，牛 春，沈晓鸿，等.重离子注入法诱变维生素B12高产菌株［J］.中国兽药杂志，2012，46(2):39－41.

［3］王立言.常压室温等离子体对微生物的作用机理及其应用基础研究［D］.北京:清华大学，2010.

［4］金丽华，方明月，张 种，等.常压室温等离子体快速诱变产油酵母的条件及其突变株的特性［J］.生物工程学报，2011，27(3):461－467.

［5］汪 晨，蔡 恒，张恒丽，等.高产琥珀酸菌株的等离子体诱变选育［J］.南京大学工业学报:自然科学版，2013，35(1):57 －60.

［6］马继花，张 萍，石彦鹏，等.马玲薯葡萄糖培养基在延胡索酸泰妙菌素菌种选育中的应用［J］.中国兽药杂志，2012，46(12):54－56，66.

［7］石彦鹏，张 丽，张 萍.硫酸亚铁对泰乐菌素发酵的影响［J］.中国兽药杂志，2009，43(6):30－31.

［8］李明仁，王菊芳，李文建.重离子束在微生物诱变育种及生物能源开发中的应用［J］.原子核物理评论［J］.2007，24(3):234－237.

［9］方晓梅，赵志甲，顾海科.泰乐菌素产生菌的空间诱变育种研究［J］.航天医学与医学工程，2005，补充卷(期)号:121－125