喹乙醇在鲫体内消除规律的研究

彭玉芬，蔡勤仁，薛良辰，吴洁珊，冯家望，凌芸辉

(珠海出入境检验检疫技术中心，广东珠海519015)

喹乙醇(olaquindox，OLA)，属于喹噁啉类抗菌药，本类药物具有广谱抗菌、促进生长双重作用。该类药物曾经被广泛应用于猪、牛、鸡、羊和水生动物促进生长，抗菌治病，但近年来的研究表明，喹乙醇及其代谢物3-甲基-喹啉-2-羟酸(3-methylquinolin-2-carboxylic acid，MQCA)有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形、致突变、致癌。我国也出台相应的测定标准［1］。美国和欧盟都禁止将喹乙醇用作饲料添加剂。《中华人民共和国兽药典》(2005版)作出明确规定，喹乙醇禁止用于家禽及水产养殖，但由于养殖者的违规使用，国内水产品中仍屡有检出喹乙醇残留。目前，喹乙醇在猪［2-3］、鸡［4-5］、兔［6］和老鼠［7］等陆生动物体内代谢的研究有见报道，但水生动物的相关研究却很少。本文建立了水产品中喹乙醇的LC-MS/MS检测方法，并对喹乙醇在鲫鱼体内的消除规律进行了研究，研究结果为水产品中喹乙醇的残留检测和不合格追溯提供了理论依据和技术手段，对保障我国食品安全具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 喹乙醇，含量为99.0%，CAS号为23696-28-8，Sigma公司生产;3-甲基喹噁啉-2-羧酸，含量94.0%，CAS号为92513-28-5，Dr.Ehrenstorfer公司生产;喹乙醇原料药，购于广州惠华动物保健品有限公司;甲醇、乙腈、乙酸乙酯、盐酸和甲酸均为色谱纯(Merck)，其他试剂均为广州化学试剂厂生产的分析纯。

1.2 仪器和设备 WATERS UPLC高效液相色谱仪，API4000Q Trap质谱仪(配有电喷雾离子源);HitachiCR22GII离心机;Zymark TurboVapⓇLV浓缩仪;Siemens冰箱;恒温水浴振荡器等实验室常用设备。

1.3 试验鱼及饲养条件 实验用鲫鱼80尾，购自珠海一源水产品养殖场，体重(250±20)g，抽样检查无喹乙醇残留，养在8个玻璃缸内10 d后用于实验，实验期间不断充气并对水体进行循环过滤，水温控制在20～25℃，实验期间每日早晚投喂适量鲫鱼饲料各1次，及时排出残饵和粪便，每2 d换水1/2体积，实验期间鲫鱼成活率为100%。

1.4 给药与采样 采用口灌给药的方式，按剂量为50 mg/kg 给药，从给药后开始，第 0、1、2、3、4、5、7、9、12、15、20天用沙网捞起，随机取鲫鱼5尾，从每尾静脉取血5 mL，放入离心管(离心管事先放入4滴1%的肝素钠)，混合均匀后离心分离血浆，剖杀，迅速取出肝胰脏及背脊两侧肌肉，分别装于白色塑料袋中，立即做好标记，保存于-20℃冰箱中。

1.5 样品前处理方法

1.5.1 喹乙醇提取 组织样品:准确称取均质后的试样5 g，精确到0.01 g，置于50 mL聚丙烯离心管中，加入5 g中性氧化铝，用20 mL乙酸乙酯+乙腈(1∶1，V/V)混合溶剂，振荡 15 min，5000 r/min离心5 min，取上清液，样品重复提取一次，合并提取液，加入10 mL正己烷，振荡2 min，5000 r/min离心5 min，弃上层正己烷。45℃吹氮浓缩至近干，用1 mL流动相溶解残渣，旋涡混匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，用于LC-MS/MS测定。

血浆:取0.5 mL血浆于玻璃试管中，加入3%的三氯乙酸3.5 mL，涡旋30 s，涡旋混匀30 s，80℃水浴 5 min，3000 r/min 离心5 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤，用于LC-MS/MS测定。

1.5.2 代谢产物MQCA的提取 准确称取2 g试样，精确到0.01 g，置于50 mL离心管中，加入15 mL乙酸乙酯，旋涡混匀，振荡15 min，4000 r/min离心5 min，取上清液转入另一支50 mL离心管中，再用15 mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液于同一离心管中。

往样品残渣中加入0.1 mol/L磷酸盐缓冲液10 mL，旋涡混匀，振荡15 min，8000 r/min 离心10 min，取上清液合并到离心管中，振荡15 min，6000 r/min离心5 min，取下层溶液至50 mL具塞离心管中。

加入盐酸 200 μL，混匀，再加入乙酸乙酯8 mL，振荡 15 min，8000 r/min 离心 10 min，上层溶液转入玻璃试管中，再用8 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并上层溶液于同一玻璃试管，55℃吹氮浓缩至干，用1 mL 0.1%甲酸-甲醇(体积比95∶5)溶液溶解残渣，旋涡混匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，用于LC-MS/MS分析。

1.6 测定

1.6.1 色谱条件 色谱柱:UPLC ACQUITY BEH C18 2.1×100 mm，1.7 μm;柱温:30 ℃;进样量:10 μL;流动相A为5 mmol/L乙酸铵(含0.1%的甲酸)，B为乙腈。梯度洗脱(表1)。

表1 梯度洗脱程序

1.6.2 质谱条件 离子源:电喷雾离子源(ESI);扫描方式:正离子扫描;检测方式:多反应选择离子检测;电喷雾电压:5500 V;雾化气:60 MPa，气帘气:20 MPa，辅助加热气:70 MPa;碰撞气:Medium，四种气体均为氮气;离子源温度:550℃;碰撞能量、去簇电压见表2。

表2 喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸部分仪器参数

1.6.3 标准曲线 将喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸标准工作液依次稀释得到0.001、0.005、0.010、0.050、0.100 μg/mL 的标准系列，由低到高的浓度进行测定，以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.6.4 回收率及精密度 在空白血浆、肌肉及肝胰脏中添加喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度0.005 μg/mL(μg/g)、0.010 μg/mL(μg/g)和0.050 μg/mL(μg/g)，每个浓度 6 个重复，按 1.5项处理方法进行处理后上机测试。

1.7 样品中喹乙醇及其代谢物的测定 给药后采集的血浆样品及组织样品的前处理按1.5项的操作方法进行，然后上机测试，将测得的峰面积值代入相应的回归方程计算出样品的浓度。

2 结果

2.1 喹乙醇及其代谢物标准曲线的制定 在建立的色谱质谱条件下，喹乙醇在0.001～0.100 μg/mL浓度范围内，峰面积(y)与浓度(x)呈良好线性关系，回归方程分别为 y＝8330x+4970(r＝0.9996)。3-甲基喹噁啉 -2-羧酸在0.001～0.100 μg/mL浓度范围内，峰面积(y)与浓度(x)呈良好线性关系，回归方程分别为y＝2490x-1410(r＝0.9999)，喹乙醇及3-甲基喹噁啉-2-羧酸的最低检测限为0.001 μg/mL(μg/g)。

2.2 回收率及精密度的测定 喹乙醇的添加回收率(%)和变异系数(%)分别在60% ～86%、4.2% ～11.8%之间，3-甲基喹噁啉-2-羧酸的添加回收率(%)和变异系数(%)分别在60% ～92%、2.6% ～10.2%之间。

2.3 喹乙醇在各组织中的残留消除 鲫鱼按剂量为50 mg/kg口灌喹乙醇，不同组织的不同时间点的肌肉、血浆和肝胰脏中的喹乙醇浓度的实测值见表3，从表中可以看出喹乙醇在鲫鱼体内的消除非常迅速，血浆第五天检测不到，组织中喹乙醇的浓度第七天小于0.001 μg/g。鲫鱼口灌喹乙醇后肌肉中谱图见图1，从谱图中可以看出喹乙醇与杂质分离良好且检测效率高。

2.4 代谢物在各组织中的残留消除规律 鲫鱼按剂量为50 mg/kg口灌喹乙醇后，不同时间点的肌肉、血浆和肝胰脏中的3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度的实测值见表4，从表中可以看出喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸在鲫鱼体内消除比喹乙醇缓慢，而且在第五天时组织中3-甲基喹噁啉-2-羧酸的浓度有缓慢回升。肌肉中喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸没有杂质干扰且峰形良好，具体见图2。

表3 鲫鱼口灌单剂量喹乙醇(50 mg/kg)后组织药物浓度(μg/g) (n＝5)

表4 鲫鱼口灌单剂量喹乙醇(50 mg/kg)后组织中代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸药物浓度(ng/g)(n＝5)

图1 鲫鱼口灌喹乙醇后肌肉MRM色谱图

图2 鲫鱼口灌喹乙醇后肌肉中3-甲基喹噁啉-2-羧酸MRM色谱图

3 讨论

喹乙醇在动物体内吸收良好且迅速，适用于防治淡水养殖鱼类细菌出血性败血症、疖疮病等疾病［8］。在动物体内代谢过程中大部分以原形物质的形式从体内排出，其余主要以代谢物的形式经肾脏排出。本实验不仅测定了血浆、组织中喹乙醇的含量，还对组织中喹乙醇代谢物进行了研究，揭示了喹乙醇在鲫鱼体内的消除规律。

实验结果表明，鲫鱼按50 mg/kg口灌喹乙醇后，鲫鱼血浆中喹乙醇的浓度1 d后为(6.56±0.49)mg/L，2 d后迅速下降到(0.18±0.04)mg/L，4 d 后喹乙醇下降至(0.0039±0.0008)mg/L，5 d后已经检测不到。肌肉中喹乙醇消除的规律与在血浆中相似，但消除的速度并不快，至3 d肌肉中喹乙醇的浓度还有(4.20±0.87)mg/kg，在第7天时完全检测不到喹乙醇。肝胰脏中喹乙醇的消除与肌肉相比，消除速率更加快速。与艾晓辉等［9］通过口灌给药方式一次性给予鲤鱼30 mg/kg的喹乙醇后消除特征基本一致。喹乙醇在鲫鱼体内消除速度比鸡［4-5］、兔［6］、鼠［7］慢。

喹乙醇代谢物3-甲基喹噁啉-2-羧酸在鲫鱼肌肉和肝胰脏中消除比较缓慢，肌肉中到15 d基本检测不到，肝胰脏中到20 d才检测不到。但有一个共同点，在第5天的时候3-甲基喹噁啉-2-羧酸浓度有不同程度的回升，然后再下降直到检测不出。通常情况下，应该是达到最大药物浓度后随着时间的延长，组织中浓度越来越低，但由于鱼是变温动物，出现药物浓度下降后又回升这种情况可能与水温的变化及鱼体中某些脏器对药物存在再吸收等因素的影响有关。这种现象在艾晓辉等［9］测定喹乙醇在鲤鱼组织中的(第12小时)浓度时出现过。

［1］农牧发［2001］38号.动物源食品中兽药残留检测方法［S］.

［2］陶琳丽，高士争，葛长荣，等.喹乙醇在猪组织中残留的数学模型分析［J］.云南农业大学学报，2009，24(3):394-398.

［3］Joe O.Boison，Stephen C.Lee，Ron G.Gedir.A determinative and confirmatory method for residues of the metabolites of carbadox and olaquindox in porcine tissues［J］.Analytica Chimica Acta，2009，637:128-134.

［4］曾振灵，董漓波，陈杖榴.喹乙醇在鸡组织的消除及残留研究［J］.畜牧兽医学报，1995，26(4):327-333.

［5］Zhao-Ying Liu，Ling-li Huang，Dong-Mei Chen，et al.The metabolism and N-oxide reduction of olaquindox in liver preparations of rats，pigs，and chinkens［J］.Toxicology Letters，2010，195:51-55.

［6］蒋永培.新饲料添加剂“喹乙醇”在兔体内代谢动力学研究［J］.畜牧兽医杂志，1987，3:8-9.

［7］Kaemmer K.Studies with olaquindox.3rd communication.Blood level pattern in rats and pigs after oral ingestion［J］.Vet.Med.Rev.1982，(1):40-58.

［8］农业部“渔药手册”编撰委员会.渔药手册［M］.北京:中国科技出版社.1998，195-196.

［9］艾晓辉，陈正望，张春光，等.喹乙醇在鲤体内的药物代谢动力学及组织浓度［J］.水生生物学报，2003，27(3):273-277.