超高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中66种兽药残留的研究

班付国，胡兴娟，2，吴宁鹏* ，彭 丽，孟 蕾，周红霞，毛建辉

(1.河南省兽药监察所，郑州450008;2.郑州大学，郑州450008;3.河南省畜产品质量安全监测检验中心许昌分中心，河南许昌461000)

兽药残留的毒性作用大多是通过长期积累而造成的，比如林可胺类药物残留可引起肾功能障碍和革兰氏阳性菌的耐药性增加;四环素类药物容易与骨骼中的钙结合，从而抑制骨骼和牙齿的生长;大环内酯类药物残留可引起过敏反应和导致携带耐药因子的菌株扩散;氯霉素可引起贫血灰婴综合征、白血病等。因此，欧盟和我国制定了相关药物的残留标志物以及在不同的动物性食品中的最大残留限量，并规定了畜牧业禁止使用的兽药种类。但是，目前滥用兽药情况比较普遍，其用量远远超过了动物治疗疾病的需要量，因此，建立兽药的残留检测方法势在必行。

国内外现有的多残留检测方法主要有LC-Q-TOF［1-3］和 LC-MS/MS［4］方法，存在检测药物的种类单一、前处理方法复杂、灵敏度低等缺点。我国在兽药多残留检测的研究起步较晚，且目前同时定量测定多种兽药的方法也较缺乏。本方法针对我国畜产品养殖过程中常用的兽药，利用UPLC-MS/MS高效分离和定性、定量准确的特点，对磺胺类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类和林可胺类等11类66种药物建立了猪肉中UPLC-MS/MS检测方法，为主管部门对市场上含有超标兽药及违禁兽药的猪肉进行有效监管提供了技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器 Acquity UPLC-XEVO TQ-S液质联用仪，配电喷雾离子源(ESI)(美国Waters公司);METTLE TOLEDO XP205电子分析天平(感量0.01mg，梅特勒-托利多仪器公司);高速冷冻离心机(德国Sigma公司);R215 Professional旋转蒸发仪(瑞士，Buchi);Organomation Associates氮吹仪(Jnc公司);超声波清洗器(昆山);Agela Technologies CleanertⓇPEP-2固相萃取柱(6 CC/500 mg)。

1.2 试剂 金刚烷胺、金刚乙胺、氟哌利多、氟哌啶醇、阿扎派隆、异丙嗪、地西泮标准品，含量均大于98%，购于百灵威公司;氯霉素、头孢喹肟、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹恶啉、磺胺二甲嘧啶、磺胺氯哒嗪、磺胺吡啶、磺胺二甲唑、磺胺甲噻二唑、磺胺二甲异嘧啶、磺胺甲氧嗪、磺胺氯吡嗪、磺胺邻二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲嘧啶、磺胺异噁唑、苯酰磺胺、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺噻唑、甲氧苄啶、金霉素、四环素、土霉素、阿奇霉素、罗红霉素、吉他霉素、林可霉素、泰乐菌素、泰妙菌素、替米考星、克拉霉素、克林霉素、安替比林、阿托品由中国兽医药品监察所提供，含量大于98%;奥硝唑、地美硝唑、卡硝唑、替硝唑、甲硝唑、罗硝唑、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、二氟沙星、那氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、萘啶酸、西诺沙星、洛美沙星、氧氟沙星、依诺沙星购于Dr.Ehrenstorfer公司，含量大于98%;氨基比林购于中国药品生物制品检定所，含量大于98%;对乙酰氨基酚、氨苯砜购于中国食品药品检定研究院，含量大于98%;甲醇、乙腈为色谱纯(Sigma公司);乙二胺四乙酸二钠、氯化钠为分析纯;实验用水为经Milli-Q净化系统制备的去离子水;PEP-2固相萃取柱(6 CC/500 mg，Agela Technologies)。

1.3 标准溶液的配制 准确称取标准品各10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中;对于难溶药物，头孢喹肟先加入适量二甲基亚砜使其溶解，再用甲醇定容，配制成1 mg/mL的标准储备液。-20℃下保存，有效期为三个月。准确移取标准储备液适量，用甲醇稀释成一定浓度的混合标准工作液。

1.4 样品前处理 称取猪肉2 g于50 mL离心管中，分别加入 200 μL 0.1 mol/L EDTA溶液和10 mL乙腈/甲醇(V/V，95∶5)提取液，涡旋混匀后，振荡20 min。于离心机上5000 r/min离心5 min，将上清液转移至25 mL鸡心瓶中。向残渣中加入10 mL乙腈/水(V/V，15∶2)溶液进行重复提取，合并两次提取液。鸡心瓶中加入0.38 g NaCl后于40℃下旋蒸至溶液剩余约1 mL。分别用1 mL乙腈和15 mL水清洗鸡心瓶，并将溶液转移至洁净50 mL离心管中，备用。PEP-2固相萃取柱依次用甲醇和水各5 mL活化，将备用液全部过柱。用2 mL水淋洗，抽干。用3 mL乙腈和3 mL甲醇分别洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干。准确加入乙腈/水(V/V，20∶80)溶液1.0 mL溶解定容，涡旋混匀，过0.22 μm微孔滤膜，上液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5 仪器分析方法 色谱柱为Waters UPLCTMBEH C18(100 mm ×1.0 mm，1.7 μm);流动相 A 为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇溶液，流动相C为水，流动相D为乙腈;其中正、负离子模式按表1梯度洗脱;流速0.1 mL/min;柱温40 ℃;进样量2 μL。

电喷雾离子源，多反应监测模式(MRM)。电离电压为2.9 kV;源温为150℃，脱溶剂温度为500℃;锥孔气流速为150 L/h，脱溶剂气流速为1000 L/h;定性离子对、定量离子对及对应的碰撞能量参考值见表2。

表1 梯度洗脱程序

表2 药物的定性、定量离子和锥孔电压、碰撞能量

续表

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2 结果

2.1 线性关系 称取空白试样，按照上述方法处理，在氮气吹干前，准确移取混合标准溶液适量，加入洗脱液中，根据各个药物的定量限LOQ制得0.5LOQ、LOQ、2LOQ、5LOQ、10LOQ、20LOQ 浓度的基质匹配标准溶液，各药物在相关浓度范围内呈良好线性相关(表3)，相关系数均大于0.99。2LOD浓度空白猪肉添加试液中66种兽药色谱图见图1。

2.2 检测限和定量限 检测限:添加一定量的混合标准溶液于2 g空白猪肉中，经过提取净化并测定，药物的信噪比S/N≥3时，即可得到药物的检测限，其结果见表3。

定量限:添加一定量的混合标准溶液于2 g空白猪肉中，经过提取净化并测定，药物的信噪比S/N≥10时，即可得到药物的定量限，其结果见表3。

2.3 方法精密度与准确度 在空白猪肉中分别添加LOQ、2LOQ、5LOQ三个浓度混合标准溶液，每个浓度做5个平行，其平均回收率、变异系数如表3所示。可以看出，66种药物的平均回收率在35%～140%之间，批内相对标准偏差均小于20%。

3 讨论与小结

3.1 液相条件优化 对于多组分分析，采用梯度洗脱更易于药物的分离。本方法以ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm ×1.0 mm，1.7 μm)作为色谱柱，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水溶液四种流动相体系，经过对比发现，正离子模式使用甲醇-0.1%甲酸水溶液，负离子模式使用乙腈-水时，能获得较好的峰型及较高的响应。

3.2 质谱条件优化 实验采用0.2 mg/L各个药物的标准溶液在电喷雾离子源正负离子模式下，采用流动注射泵连续进样方式进行全扫描，确定准分子离子。以分子离子为母离子对子离子全扫描，在多反应监测模式下对其质谱条件进行优化。最后选取丰度较强的子离子作为定量离子，丰度次之的为定性离子。磺胺类、氟喹诺酮类、林可胺类、四环素类、硝基咪唑类、大环内酯类等药物在［M+H］+模式下灵敏度较高，故选择在正离子模式下进行测定。氯霉素在［M-H］-模式下灵敏度较高，故选择在负离子模式下进行测定。

图1 空白猪肉添加试液中66种兽药色谱图(2LOD浓度)

表3 猪肉中66药物的线性范围、相关系数、平均回收率及RSD

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3.3 样品前处理条件优化 参考相关文献［1-3］，提取多残留药物时一般使用甲醇、乙腈、TCA溶液或者乙腈、甲醇和一定比例水的溶液作为提取液。本实验考察了乙腈、甲醇、乙腈/甲醇(95∶5，V/V)、乙腈/水(15∶2，V/V)和 5%TCA 溶液［5］等提取液，实验结果表明:乙腈/甲醇(95∶5，V/V)和乙腈/水(15∶2，V/V)共同使用时，66种药物的回收率相对较高，且无杂质峰干扰。提取液中水和200 μL 0.1 mol/L EDTA溶液的存在能明显提高四环素类和大环内酯类药物的回收率［6-8］，这是因为EDTA能和组织中的重金属离子络合，从而避免这两类药物因络合沉淀而造成回收率降低。

在测定多残留药物时，对提取液浓缩后直接进样，省去固相萃取柱净化的步骤，从而缩短操作时间。但是基质中的杂质会堵塞色谱柱，干扰离子源信号。为更好的净化上样液，本实验采用了Agela Technologies CleanertⓇPEP-2固相萃取柱对提取液进行浓缩净化，该柱对各类极性、非极性化合物具有均衡的吸附作用，适用于多组分药物的同时净化。并对洗脱液和淋洗液进行了考察，当使用3 mL乙腈3 mL甲醇作为洗脱液，2 mL水作为淋洗液时各个药物的回收率最优，且具有较好峰形。

本文采用UPLC-MS/MS技术建立了猪肉中66种兽药残留的快速筛查分析方法。该方法快速、准确、灵敏度高、筛查范围广，适合于猪肉中兽药残留的快速筛查分析，为畜产品进行风险监测提供了一种有力的技术手段。

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