冬凌草中熊果酸提取工艺优化

2014-11-23裴保河

中国兽医杂志 2014年6期

裴保河

（鹤壁市疾病预防控制中心，河南鹤壁 458030）

冬凌草(Rabdosia rubescens(Hemsl.)Hara)又名冰凌草、延命草、彩花草等，为唇形科香茶属多年生草本或亚灌木，自然分布于太行山南部。自古以来被太行山区的民间常年当作茶叶饮用。因其清热解毒、清咽利喉、消止痛的功能盛行于当地，被誉为“神奇草”。1972年，中国食管癌研究中心，发现冬凌草具有独特的抗食管癌，贲门癌、原发性肝癌功效，从此被广泛应用于临床[1]。进入21世纪以来，国际肿瘤病学界和新药研发机构对冬凌草的抗癌作用格外关注，其化学成分及药理活性研究取得较大进展[2]，从全株植物分离得到大量二萜类化合物、一些三萜、甾体、黄酮、生物碱、挥发油、氨基酸、有机酸及其他类化合物[3]。药理研究表明，多个成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌消炎、降血糖、抗突变、免疫等活性[4-8]。冬凌草中的主要三萜类成分熊果酸具有较强的抗肿瘤活性[9]。研究表明[10]，熊果酸不仅对多种致癌、促癌物有抵抗作用,而且对多种恶性肿瘤细胞有抑制生长作用。因此提取冬凌草中熊果酸成分，开发新药及保健食品具有广阔的前景。

目前，关于冬凌草中冬凌草甲素等二萜类化合物提取研究较多[11]，但有关冬凌草中熊果酸的提取报道较少，袁珂[12]采用超临界二氧化碳技术萃取冬凌草中熊果酸，得率较高，但该法时间较长。超高压提取技术是在常温条件下提取植物原料中有效成分，提取时间短、能耗低、有效成分破坏小[13]，目前在冬凌草中熊果酸的提取上还未见报道。本文研究超高压提取冬凌草中熊果酸的工艺条件，在单因素试验的基础上，采用L9(34)正交试验优化提取工艺，为冬凌草的进一步开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料 2012年6月在鹤壁市食品药品监督管理局检验中心进行试验。冬凌草，采自河南省鹤壁市淇河岸边，新鲜成熟植株地上部分→70℃烘干→粉碎→20目过筛→真空包装→备用；熊果酸对照品，中国药品生物制品检定所；乙醇试剂均为国产分析纯。

SFP超高压处理系统，英国SFP公司；XH-600US超声波细胞粉碎机，北京祥鹄科技发展有限公司；旋转蒸发器，广州市捷晶能源科技有限公司；Agilent 1100高效液相色谱系统，Agilent公司。

1.2 试验方法

1.2.1 超高压提取冬凌草中熊果酸在冬凌草粗粉中，加入不同体积、不同浓度的乙醇溶液，混合均匀后装入聚乙烯塑料袋，进行真空包装，然后放入超高压装置的压力腔中，高压处理一定时间，处理后过滤，3 500 r/min离心15 min，离心后减压浓缩，测定熊果酸含量，计算熊果酸的得率。

1.2.2 回流提取冬凌草中熊果酸在冬凌草粗粉中，按固液比1∶20(g:mL)加入75%乙醇溶液，加热回流2 h。过滤，3 500 r/min离心15 min，离心后减压浓缩，测定熊果酸含量，计算熊果酸的得率。

1.2.3 超声提取冬凌草中熊果酸在冬凌草粗粉中，按固液比1∶20(g:mL)加入75%乙醇溶液，采用220 W超声处理30 min,过滤，3 500 r/min离心15 min，离心后减压浓缩，测定熊果酸含量，计算熊果酸的得率。

1.2.4 熊果酸的HPLC测定参照HPLC方法测定熊果酸[14]，色谱柱（Phenomsil BDS C18，4.6 mm×200 mm，5μm)，流动相：CH3OH：H2O：HAc为85∶15∶0.3，流速：1 mL/min，柱温：35℃，检测波长为215 nm。峰面积A与熊果酸浓度C（mg/mL）之间的回归方程为A=381.63C-3.0644（R2=0.9996）。

2 结果与分析

2.1 超高压提取冬凌草中熊果酸单因素实验

2.1.1 固液比对熊果酸提取得率的影响采用70%乙醇溶液为溶剂，UHP压力350 M下保压4 min进行提取，不同固液比对熊果酸提取得率的影响见图1。

由图1可见，随着固液比中溶剂用量的增加，熊果酸的提取得率增加，但当固液比达到1∶20（g：mL）后，再增加溶剂用量，得率增加缓慢。同时，过多的溶剂用量会带来后续浓缩的强度增加，因此，综合考虑，采用固液比1∶20较好。

2.1.2 乙醇浓度对熊果酸提取得率的影响采用不同浓度的乙醇溶液为溶剂，固液比1∶20（g：mL），UPH压力350 M下保压4 min进行提取，乙醇浓度对熊果酸提取得率的影响见图2。

由图2可见，随着乙醇浓度的增加，熊果酸的提取得率增加，但当乙醇浓度达到70%后，再增加乙醇浓度，得率反而下降。

2.1.3 UHP压力对熊果酸提取得率的影响采用70%乙醇溶液为溶剂，固液比1∶20（g：mL），在不同的UHP压力下保压4 min进行提取，UHP压力对熊果酸提取得率的影响见图3。

由图3可见，随着UHP压力的增加，熊果酸的提取得率增加，但当UHP压力达到300 MPa后，再增加压力，得率反而下降。因此，采用300 MPa提取熊果酸较好。

2.1.4 保压时间对熊果酸提取得率的影响采用70%乙醇溶液为溶剂，固液比1∶20（g：mL），在UHP压力300 MPa下保压不同时间进行提取，保压时间对熊果酸提取得率的影响见图4。

由图4可见，随着UHP时间的增加，提取得率增加，但当UHP时间达到4 min后，再增加时间，得率增加缓慢。因此，采用4 min提取熊果酸较好。

2.2 提取工艺条件的优化在单因素的基础上，选用L9(34)正交试验表，以熊果酸得率为指标，考察固液比、乙醇浓度、UHP压力、UHP时间对熊果酸得率的影响，试验设计和结果分别见表1和表2。

表1 因素与水平

表2 正交试验

由表2极差分析结果可知，各因素对熊果酸得率的影响程度依次为：D＞C＞B＞A，即：UHP时间＞UHP压力＞乙醇浓度＞固液比。优化的提取条件为 A3B3C3D2,即：UHP时间4 min、UHP压力320 MPa、乙醇浓度75%、固液比1∶22。采用冬凌草2 kg，按上述最佳条件进行验证试验，熊果酸得率为0.322%。

2.3 不同提取方法提取熊果酸的比较将冬凌草分别采用超高压提取、回流提取和超声方法进行提取，比较提取后熊果酸得率和提取所用的时间，结果见表3。

表3 3种方法提取冬凌草中熊果酸的得率和提取时间

从表3中可见，3种不同的提取方法中，超高压提取不仅得率高，而且提取时间短。

3 讨论

冬凌草是一种资源丰富的药食两用的植物资源，是开发保健食品的较好原料,为有效对其利用,对其活性成分熊果酸的分离提纯药理学进行深入研究，开发精制、深加工转化产品是其发展方向。

目前熊果酸最常用的方法是回流法，该法对设备条件要求不高，操作方法简单，但熊果酸提取率不高，且提取时间长；通过采用超声强化提取可提高得率，缩短时间，但超声容易造成有效成分的破坏，且提取仍然需要30 min以上；超微粉碎方法通过对细胞进行破坏，提高提取得率，但其对细胞的破坏程度有限，得率还有待提高。本研究采用超高压提取，是通过加压破坏冬凌草的细胞，促进熊果酸溶出。在提取过程中，细胞在压力作用下破坏，但由于为非热提取，熊果酸破坏小，且提取工艺中，细胞在几分钟内即破坏，提取时间大大缩短，得率得到提高。