新疆库车猪场猪圆环病毒2型感染调查

刘居萍，乔 军，葛阳春

（1.新疆石河子大学动物科技学院，新疆 石河子 832003；2.新疆库车县动物卫生监督所，新疆 库车 842000）

猪圆环病毒病(PCVD)是由猪圆环病毒(PCV)引起的一种多系统功能障碍性疾病，导致机体免疫抑制。圆环病毒属于圆环病毒科圆环病毒属的成员，是所有已知动物病毒中最小的病毒粒子，为单股环状DNA病毒。基因组由一个单股环状组成，基因组全长一般为1 766～1 768 nt。PCV-2根据基因组遗传距离的大小可以划分为3个基因型，分别为PCV-2a、PCV-2b和PCV-2c，其中PCV-2c基因型仅在丹麦有发现[1]。临床上主要病症以新生仔猪先天性脑震颤和断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)最为常见，主要表现为进行性呼吸困难，消瘦，体表淋巴结肿大，腹泻，黄疸，贫血，甚至死亡，给养猪业造成了巨大损失。猪圆环病毒分为2个血清型，PCV-1和PCV-2。其中PCV-1不引起临床症状，广泛存在于正常猪体各器官组织及猪源细胞。PCV-2对各种年龄的家猪和野猪均有致病性，目前认为PCV-2在世界各地到处都存在，无论是否发生PCVD，是近年来兽医界引人注目的一种新的猪传染病。自从1991年加拿大首次报道了PCV-2是PMWS的主要病原以来[2]，其在世界各地迅速蔓延。我国也于2000年检测到了该病毒的存在[3]，该病毒在我国猪群的感染率近乎50%，给我国的养猪业也造成了严重的损失。

PMWS既可水平传播，导致断奶仔猪发病死亡，亦可垂直传播，引起繁殖障碍。PCV-2主要侵害免疫系统，导致感染猪免疫抑制，降低机体对其他病原体的抵抗力和疫苗的反应性，可导致多种疾病的发生，容易导致其他病毒和细菌的继发感染，使死亡率明显升高。近年来，随着库车县养猪业的快速发展，一些养猪场从外地引入种猪。伴随在引种的同时，一些新的猪病也带入本县。近两年，发现养猪场每年疑似猪圆环病毒病的病例不断增加，为了了解库车县猪圆环病毒病流行情况，笔者于2012年8月至2012年12月在全县6个区域的32个猪场随机抽取443份血清样品，应用ELISA方法检测了PCV-2抗体阳性率。通过对不同猪场不同生产阶段猪群PCV-2血清流行病学研究，分析PCV-2在我县不同猪场和不同生产阶段猪PCV-2的感染状况。为进一步证实该病在我县的存在，对可疑死亡生猪的病料组织进行了猪2型圆环病毒全基因组的克隆、测序分析，不但为该病积累了流行病学资料，而且也为我县对该病的科学防控提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 血清样品和病料组织 选择库车县部分有代表性的养猪场32个，随机采样。按相关的生物安全要求进行无菌采血，分离血清备用，并对猪的日龄、防疫情况以及临床健康状况作详细记录。共采集443份血清。将库车县猪场疑似PCV-2感染的发病猪采集的淋巴结、脾脏、肺脏及肝脏等组织，共采集18头病猪病料，-20℃保存备用。

1.2 主要试剂 猪圆环病毒病酶联免疫吸附(ELISA)诊断试剂盒(北京世纪元亨动物防疫技术有限公司)，试剂生产批号：PCV20120618E。Taq plus DNA聚合酶、dNTPs、琼脂糖凝胶电泳回收试剂盒，购自北京诺维森生物科技有限公司。pMD18-T载体，购自大连TaKaRa公司。病毒基因组提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司、Marker2000，购自广州东盛生物科技有限公司。

1.3 PCV-2引物的设计 根据DNAMAN生物软件针对PCV-2基因设计PCR引物，扩增长度为982 bp，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列 PCV-N1：5'-ACCAGCGCACTTCGGCAGCG-3'；PCV-N2：5'-TCATATGGAAATTCAGGGCA-3'。PCVN3：5'-TTACCAGCAATCAGACCCCG-3'；PCV-N4：5'AATACTTACAGCGCACTTCT 3'。

1.4 ELISA检测血清PCV-2抗体 依照猪圆环病毒病酶联免疫吸附(ELISA)诊断试剂盒操作说明步骤进行，洗涤液20倍稀释配制、样品1∶5的体积稀释、加样、封膜、孵育、洗版、加底物、加终止液。按照被检样品OD450值＜临界值，为PCV-2抗体阴性；被检样品OD450值≥临界值，为PCV-2抗体阳性的标准判定结果。

1.5 病料DNA提取 用天根生化科技(北京)有限公司提供的DVA病毒基因组提取试剂盒方法提取病料中的DNA，试剂盒里有缓冲液GB、漂洗液RW、蛋白酶K、吸附柱、收集管、ddH2O等。将病猪的病料5 g左右用1～1.5 mL生理盐水研磨，研磨约5 min，研磨后液体放入1.5 mL EP管中，12 000 r/min离心5 min，取上清液。按照组织/细胞DNA抽提试剂盒的操作说明提取总DNA。

1.6 样品中PCV-2的检测 通过对PCR扩增条件和反应程序的优化，确定方案如下：取提取的DNA为模板4 μL，引物PCV-N1（25 pmol/μL）、PCV-N2（25 pmol/μL）各 1μL，PCR Mix 10 μL，水 6 μL，混匀。PCR采用20 μL的反应体系，反应条件为：95℃预变性4 min；95℃变性50s，51℃退火40s，72℃延伸1 min 20s，36个循环；72℃延伸l0 min；4℃无限延伸。PCR反应进行36个循环，扩增反应完成后，PCR扩增产物在l%琼脂糖凝胶中，以0.5×TAE缓冲液，120 V电压电泳30 min，溴化乙锭染色。电泳结束后，在紫外线下观察，记录结果并拍照保存。

1.7 阳性样品PCV-2全序列的扩增与克隆 在鉴定为PCV-2阳性的样品中，选取条带较亮样品的DNA,用引物PCV-N1和PCV-N2进行全序列的扩增，反应体系为20μL，反应条件为：95℃预变性4 min；95℃变性50s，51℃退火40s，72℃延伸1 min 20s，36个循环；72℃延伸l0 min，4℃无限延伸。将PCR阳性扩增条带进行胶回收纯化，采用北京诺维森生物科技有限公司生产的DNA回收试剂盒回收扩增出来的DNA片段。将回收产物与pMD-19-T载体16℃连接过夜，连接反应体系：回收产物 4.5 μL，pMD-19-T载体 0.5 μL，SolutionⅠ连接酶5 μL，共10 μL。将连接产物全部转化感受态细胞，37℃培养15 h后，挑取白色菌落接种于10 mL含Amp的液体LB培养基中，37℃振荡培养12 h，然后做菌落PCR鉴定。在含有Amp的LB固体平板上挑取单个白色菌落作为模板进行菌落PCR扩增，反应体系与条件同前。取10 μL反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，在凝胶成像系统下进行观察。

1.8 库车县PCV-2流行株基因分型 选取经鉴定正确的阳性重组质粒的菌落，激活培养后送华大基因生物工程技术服务公司进行测序，然后与国内外流行株进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性分析。

2 结果

2.1 血清中PCV-2抗体的ELISA检测结果 在被检的443份血清中，共检出PCV-2抗体阳性的血清367份，平均阳性率为82.84%。从表1可知，不同生长阶段猪阳性率不同，断奶仔猪、育肥猪、母猪、公猪的PCV-2阳性率分别是79.09%、83.5%、90.27%、83.3%。

表1 不同年龄阶段猪血清样品中PCV-2抗体检测

2.2 不同区域猪PCV-2血清抗体检测结果 不同区域猪场饲养管理、饲养环境不同，猪群血清PCV-2抗体平均阳性率有较大差异。根据现场调查情况及表2可以看出,饲养环境、饲养管理好的区域猪场阳性率相应较低。

2.3 PCV-2的基因组PCR扩增结果 将采取的18头生猪组织无菌研磨，从中提取DNA，将其进行PCR扩增，之后取扩增产物20 μL进行电泳检测，结果在第1、3、5、6、7、9、11、12、17、18孔分别出现了1条 982 bp左右的条带（图1、图2），与预期片段大小一致。

2.4 PCV-2的测序结果分析 将鉴定正确的重组载体送华大基因生物工程技术服务公司进行测序，测序结果经过在基因库里进行比较此次分离鉴定的PCV-2与基因库上已提交的PCV-2的其他菌株如 GD-sz、DF-1、NY0912、GXXJ1104、CZ1005存在着99%的同源性。

表2 不同区域猪血清样品中PCV-2抗体检测

3 讨论

本试验血清样品来自本县多个猪场的不同日龄猪群，具有一定代表性。通过ELISA检测了32个猪场的443份血清样品，对不同养殖场、年龄猪的血清学调查数据进行了综合分析。从6个区域的血清样品PCV-2抗体检测结果显示，总抗体的阳性率为82.84%，这与其他有关报道的抗体总阳性率基本相符合[4]。ELISA结果显示，库车县PCV-2抗体总平均阳性率较高，应该引起高度重视。

本次调查显示，所有受检猪场均存在不同程度PCV-2感染。对血清来源不同日龄段进行分析，不同日龄段的猪群血清PCV-2抗体平均阳性率有较大差异。母猪抗体阳性率最高为90.27%，其次为公猪和育肥猪，抗体阳性率分别是83.3%、83.5%，仔猪抗体阳性率最低为79.09%，这与先前报道的PCV-2病毒感染随猪的年龄增长而升高结论是一致的[5]，与国内报道的同一猪群猪的年龄越大，PCV-2的抗体阳性率就越高一致[6]。

经过对库车县生猪的组织病料进行PCV-2的病原学检测，检测了18份病料，阳性病料10份，阳性率是55.6%。测序结果可以发现与其他地方的PCV-2相比，PCV-2的流行和分布具有一定的地域性，在已确定库车县的生猪未经免疫的时候已经存在PCV-2病毒，为我县以后的预防和控制此病提供了科学的数据。分析和确诊我县PCV-2毒株的基因组，对于研究其分子流行病学具有十分重要的意义。

PCV-2感染在我国猪群中已十分普遍，现己证实圆环病毒会导致断奶仔猪多系统衰弱综合征(PMWS)的主要病原猪是圆环病毒的天然宿主,病毒通过胎盘垂直传播,或在猪群中水平传播，各种年龄段、不同性别的猪都可感染，公猪和母猪发病率高。由于PMWS是一种免疫抑制性疾病，往往会给养猪业造成严重的威胁和损失。因此各养殖场应严格按生猪计划免疫程序，提高其他疫病的免疫保护率，减少混合或继发感染。重点加强猪瘟、高致病性猪繁殖与呼吸综合征的免疫，同时加强猪伪狂犬病、猪细小病毒病的免疫工作，提高猪的抵抗力，减少其他疾病与猪圆环病毒病的协同作用，从而降低生猪疫病的发生。

[1]蔡林，胡冬梅，李晓霞，等.猪圆环病毒2型10JS-2株的分离与全基因组序列分析[J].中国畜牧兽医，2012，39(7):6-10.

[2]王忠田，杨汉春.规模化猪场猪圆环病毒2型感染的流行病学调查[J].中国兽医杂志，2010，46(5):3-4.

[3]王亚丹，卢权威，陈红英，等.猪圆环病毒2型河南株全基因组的克隆与序列分析[J].中国兽医学报，2012，32(10):1429-1434.

[4]赵东升，刘有昌，安福生，等.近年来我国猪圆环病毒病的流行状况及分析[J].养猪，2009，1:57-59.

[5]卢寄军，王祝荣，张进.湖南省猪圆环病毒2型流行病学调查[J].中国动物检疫，2012，29（2）：42-43.

[6]高利波，高洪，赵汝,等.猪圆环病毒2型感染血清学调查[J].中国畜牧兽医，2011，38（12）:207-208.