HPLC－PDAD法检测3种中兽药散剂中违规添加4种喹诺酮类药物的研究

2014-11-23刘自扬董玲玲万仁玲

中国兽药杂志 2014年4期

刘自扬，董玲玲，范强，王雷，万仁玲

(中国兽医药品监察所，北京，100081)

中兽药散剂的治疗作用通常见效较慢，某些兽药生产者为提高疗效、占领市场而在中兽药散剂中违规添加化学药物，而养殖企业在不知情的情况下使用含有化学药物的“中兽药”，必然导致滥用药物的现象发生，产生不可预知的动物性产品中兽药残留超标，易诱发细菌耐药性，直接关乎动物源性食品的安全。本研究建立的反相高效液相色谱法简便、快速、准确，可用于肥猪散、健胃散、银翘散3种中兽药散剂中违规添加的氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星4种喹诺酮类药物的检测。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695e高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器PDA2996、自动进样器和Empower 2工作站;分析天平XS205型，梅特勒－托利多仪器(上海)有限公司;超声波处理器KQ300江苏昆山超声波仪器有限公司。

1.2 药品与试剂氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星(盐酸盐)、恩诺沙星对照品，均来自中国兽医药品监察所;磷酸为分析纯，三乙胺、甲醇、乙腈为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 样品制备自制中药散剂:按兽药典中肥猪散、健胃散、银翘散处方［1］规定的药材及配比，自行粉碎、混合均匀;模拟样品:参考氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星与对应散剂的临床用量［2－3］，按添加比例 = 化药临床用量/中药临床用量计算确定添加比例为1%，取自制中药散剂，按1%添加测试药物［4］，研匀，即得。

2.2 色谱条件与系统适应性采用Waters AtlantisⓇT3 4.6 mm ×250 mm，5 μm(十八烷基硅烷键合硅胶)色谱柱。以磷酸溶液(磷酸3.0 mL加水1000 mL，用三乙胺调pH值至3.0±0.1，加乙腈53 mL，摇匀，即得)为流动相A;乙腈为流动相B;甲醇为流动相C;按 A∶B∶C 为 85.5∶7.0∶7.5 进行洗脱。二极管阵列检测器，采集波长范围为200～400 nm;分辨率为1.2 nm。氧氟沙星与诺氟沙星色谱峰分离度应大于1.5，结果见图1。因四种喹诺酮类药物中氧氟沙星与诺氟沙星较难完全分离，实现了以等度洗脱的方式使氧氟沙星与诺氟沙星色谱峰完全分离，则这四种喹诺酮类药物色谱峰的分离度就能够符合要求［5－6］，结果见表1。

图1 氧氟沙星、诺氟沙星光谱及色谱图

表1 氧氟沙星、诺氟沙星系统适应性结果

2.3 线性范围取测试药物12.5 mg，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)50.0 mL，量取 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL分别置25 mL量瓶中，加流动相 A至刻度，摇匀。各取10 μL注入液相色谱仪，同时记录光谱图和283 nm波长处的色谱图。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果见表2。

表2 四种喹诺酮类药物线性结果表

2.4 回收率取自制散剂1.25 g，分别精密加入测试药物10、12.5、15 mg，分别加 2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)50.0 mL，超声处理 15 min，稍放置，滤过，各取滤液 2.0 mL，加流动相 A 至 10.0 mL，摇匀，滤过。每个浓度各制备3份平行样，各取10 μL注入液相色谱仪，同时记录光谱图和283 nm波长处的色谱图。结果见表3。

表3 回收率试验结果表

2.5 检出限对照品工作溶液:取测试药物12.5 mg，加2%磷酸－乙腈(1∶1)适量超声使溶解并稀释至刻度，摇匀;精密量取2 mL，置50 mL量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀 (10 μg/mL)。散剂溶液:自制散剂1.25 g，置50 mL具塞锥形瓶中，加2%磷酸－乙腈(1∶1)50 mL，超声15 min，滤过，即得。检出限测试溶液:分别取散剂溶液和对照品工作溶液，用流动相A稀释至被测药物的浓度分别为0.5、1、2 μg/mL。取检出限测试溶液 10 μL 注入液相色谱仪，同时记录光谱图和283 nm波长处的色谱图。以光谱图不失真的浓度作为检出限［4］，测得氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星分别在银翘散、健胃散、肥猪散中的检出限均为200 mg/kg。

2.6 供试品测定取模拟样品1.25 g，加2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)50.0 mL，超声15 min使溶解，各取2.0 mL，加流动相 A 至10.0 mL，摇匀，滤过，得供试品溶液。分别取供试品溶液、对照品工作溶液、散剂溶液各10 μL注入液相色谱仪，同时记录光谱图和283 nm波长处的色谱图［7］。结果显示，3种散剂在4种喹诺酮类药物出峰处无干扰，供试品溶液色谱峰和对照品溶液相应色谱峰保留时间及光谱图一致。

3 讨论与分析

3.1 目标化合物的选择喹诺酮类药物能通过干扰DNA、RNA及蛋白质的合成而起杀菌作用。农业部批准的喹诺酮类药物［5，8］有9种，分别是:氧氟沙星、诺氟沙星、甲磺酸培氟沙星、环丙沙星、洛美沙星、甲磺酸达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、二氟沙星等(不同的盐不重复计算)，其中以氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星4个喹诺酮类药物应用最为广泛，因此也常常成为不法中兽药生产企业为提高产品疗效而添加的药物。试验选择常用的肥猪散、健胃散和银翘散为目标散剂，选择氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星为测试药物。

3.2 提取溶剂的选择由于中药成分复杂，为减小其本底对测定的干扰，应尽可能增加提取溶剂中乙腈的比例［4］，但测试药物的溶解度又随着乙腈比例的增加而减小。因此，初步选定流动相A与乙腈的混合溶液作为提取溶剂，进行回收率试验，结果偏低，且RSD偏高。遂又采用不同浓度的三乙胺溶液与乙腈的混合溶液，以及不同浓度的磷酸溶液与乙腈的混合溶液分别作为提取溶剂进行回收率试验，最终发现水相中的三乙胺是导致回收率结果偏低的原因。最终确定提取溶剂为2%磷酸溶液－乙腈(1∶1)。

3.3 色谱条件的选择喹诺酮类药物的母体结构相同，理化性质极为相似，因此仅选择乙腈作为有机相不能实现完全分离［9］。考虑到乙腈较甲醇的反相洗脱强度大，故在流动相中加入适量甲醇，以此来降低反相洗脱强度，达到分离选择性微调的目的。再对水相、乙腈和甲醇进行三因素三水平正交设计，最终确定流动相比例，研究之初以实现9种喹诺酮类药物的色谱分离为目标，还考察了梯度洗脱程序，最终实现了9种药物的有效分离。在此研究基础上，变梯度洗脱为等度洗脱，建立了实现氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星有效分离的色谱条件。

3.4 峰纯度检查本法在对中兽药散剂中违规添加氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星检查时，除了通过对比中兽药散剂中未知色谱峰与四种喹诺酮类药物的出峰时间和光谱数据进行定性外，还使用Empower工作站检查四种喹诺酮类药物相应色谱峰的纯度。结果表明四种喹诺酮类药物的纯度角度均小于阈值，根据Waters色谱工作站的色谱峰纯度理论，可认为四种喹诺酮类药物色谱峰均是单一物质峰，方法可行。