高效液相色谱法测定板蓝根注射液中(R，S)

高效液相色谱法测定板蓝根注射液中(R，S)－告依春的含量

2014-11-23班付国周红霞刘素梅张跃京

中国兽药杂志 2014年4期

韩立，班付国，周红霞，王林，刘素梅，张跃京

(1.河南省兽药监察所，郑州450008;2.河南省康星药业股份有限公司，郑州451464)

板蓝根注射液为十字花科植物菘蓝(Isatis Indigotica Fort.)的干燥根，以水提醇沉法提取后制成的灭菌水溶液。作为一种清热解毒、凉血利咽的中兽药注射液，它具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、增强免疫的作用，尤其在抗病毒方面疗效确切［1－2］，用于治疗家畜流感、仔猪白痢、肺炎及某些发热性疾病。板蓝根注射液的成分复杂多样，主要有靛蓝、靛玉红、(R，S)－告依春、多种有机酸、核苷、氨基酸等多种成分［3－4］。以往报道的含量测定方法多为测定板蓝根注射液中靛蓝、靛玉红、有机酸、氨基酸的含量［5－7］，但该制剂为水煎提取液，靛蓝、靛玉红为脂溶性，在水提液中溶解性小，因此难以作为含量控制指标。(R，S)－告依春为主要抗病毒活性成分，又为水溶性，因此有必要建立板蓝根注射液中(R，S)－告依春的含量测定方法，用以控制板蓝根注射液的含量。

1 仪器与试剂

Waters超高效液相色谱仪(美国Waters公司)配置TUV紫外检测器检测器，Empower2色谱工作站采集数据。电子天平(BP211D)，德国Sartorius公司。超纯水装置，Milli－Q Advantage A10，美国密理博公司。

甲醇(色谱纯)，磷酸(分析纯)，中性氧化铝(层析用)，纯化水，(R，S)－告依春对照品(含量99.9%，批号110713－200911，中国药品生物制品检定所)。板蓝根注射液样品6批(批号分别为20130701， 20130702， 20130703， 20130501，20130502，20130503，均由 1家兽药生产企业提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验流动相为甲醇－0.02%磷酸溶液(7:93);色谱柱:Waters XBridge C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;检测波长 245 nm;流速1.0 mL/min;进样量:10 μL;柱温30 ℃。理论板数按R，S－告依春峰计算不低于2400，主峰的保留时间约为12 min。结果见图1、图2。结果表明在上述色谱条件下板蓝根注射液分离效果好，R，S－告依春和其他组分达到基线分离。

图1 对照品色谱图

图2 板蓝根注射液色谱图

2.2 对照品溶液的制备精密称取(R，S)－告依春对照品10.36 mg，置250 mL量瓶中，加甲醇制成每 mL 含41.4 μg 的溶液，过 0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.3 供试品溶液的制备精密量取板蓝根注射液5 mL，过中性氧化铝柱(内径为1.5 cm，5 g)，收集流出液，再用15 mL水洗脱，流出液和洗脱液合并至25 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察取R，S－告依春对照品溶液，分别稀释成 1、5、10、20、40 μg/mL，精密量取10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，回归方程为:y ＝ 77327x+519.2，相关系数 r＝ 0.9998，在1～40μg/mL的浓度范围内，对照品具有良好的线性关系(图3)。

图3 R，S-告依春标准曲线图

2.5 精密度试验精密吸取(R，S)－告依春对照溶液10 μL注入色谱仪，记录色谱图，连续进样6次测定峰面积。结果相对标准偏差(RSD)为0.31%，表明系统精密度符合要求。

2.6 稳定性试验取同一批供试品溶液，分别在样品处理后的 0，1，2，8，12 h 进样，测定峰面积，考察样品稳定性。结果在12 h内含量下降率仅为0.13%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7 重复性试验取批号为20130701的板蓝根注射液，精密量取5 mL，共6份，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件进样测定，计算含量及RSD。结果样品中(R，S)－告依春的含量为 37.8 μg/mL，RSD 为 0.03%，表明该方法重复性良好。

2.8 回收率试验取批号为20130701的板蓝根注射液，精密量取2.5 mL，共6份，用移液枪分别加入0.4 mg/mL标准贮备液0.236 mL(相当于约94.5 μg的(R，S)－告依春)，按照 2.3 项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件测定，计算平均回收率及RSD，结果见表1。结果表明，该方法平均回收率为98.6%，RSD为0.36%，说明方法的回收率较高，重复性良好。

2.9 样品的测定取同一公司5批板蓝根注射液样品，每批量取两份，按供试品处理方法处理。取10 μL样品溶液注入色谱仪，记录色谱图，平行进样两次，计算平均含量。各批次样品的含量见表2。结果表明5批板蓝根注射液含板蓝根以(R，S)－告依春计，在36.2 ～42.5 μg/mL 之间。

表1 (R，S)-告依春回收率试验结果

表2 样品测定结果

3 讨论与小结

3.1 样品提取方法的选择板蓝根注射液为板蓝根水浸出物的灭菌水溶液，主要工艺为加水煎煮，浓缩，醇沉之后加水定容，每1 mL相当于0.5 g原生药。(R，S)－告依春溶于三氯甲烷、乙醇、甲醇，也能溶于沸水，不溶于冷水。试验分别比较了甲醇、70%甲醇、30%甲醇、纯水作为溶剂进行稀释提取。结果发现室温条件下(20～25℃)用纯水提取的回收率最高，而用10℃以下的冷水提取时回收率有明显下降，这与石燕红［8］的结论相符。因此，试验选用纯水在室温条件下提取。考虑到(R，S)－告依春在冷水中溶解度很小，应尽量避免使用冷水提取。

3.2 样品的净化试验比较了样品过中性氧化铝柱和不过中性氧化铝柱的效果。发现不过中性氧化铝柱时，供试品溶液颜色较深，进样后杂质峰较多，很难与目的峰分离。当样品过中性氧化铝柱后，供试品溶液颜色变浅，杂质峰明显减少，样品的含量几乎没有变化。可以推断，色素等杂质被中性氧化铝吸附，但(R，S)－告依春基本都被洗脱下来。

3.3 样品的含量试验考察了同一公司6批样品，(R，S)－告依春含量范围为 36.2 ～42.5 μg/mL。由于药材来源不同，不同公司的生产工艺存在差异，板蓝根注射液中(R，S)－告依春含量相差可能较大［9］。参照《中华人民共和国药典》板蓝根和《兽药国家标准》(化学药品、中药卷)板蓝根注射液有关标准［10－11］，有必要对板蓝根注射液成品中(R，S)－告依春的收率以及不同来源的板蓝根注射液中(R，S)－告依春含量进行进一步的测定和考察，以制定出合理的含量限度。

3.4 方法的评价现有文献报道了几种不同的高效液相色谱流动相条件对(R，S)－告依春进行含量测定，主要包括乙腈－磷酸水系统［12］、乙腈－冰乙酸水系统［13］等流动相系统，试验对这几种方法分别进行了考察，发现采用甲醇－0.02%磷酸水溶液(7∶93)流动相系统效果最好，方法学考察均符合要求。

3.5 小结试验建立了板蓝根注射液中(R，S)－告依春含量测定的高效液相色谱方法。该方法简单快速，灵敏度高，重复性好，可以有效控制板蓝根注射液中(R，S)－告依春的含量，并为板蓝根注射液的质量标准修订提供参考。

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［4］肖珊珊，金郁，孙毓庆，等.板蓝根化学成分、药理及质量控制研究进展［J］.沈阳医科大学学报，2003，20(6):455 －459.

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［7］王欣，孟宪杰，张懿.高效液相色谱测定板蓝根注射液中三种核苷的含量［J］.现代中西医结合杂志，2012，21(6):646 －647.

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［10］国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版一部［S］.