NADPH 氧化酶在氟诱导小胶质细胞氧化应激中的作用

胡玉华，颜 凌，刘子酉，席淑华

（1.厦门医学高等专科学校，福建 厦门 361000；2.中国医科大学公共卫生学院，辽宁 沈阳 110001）

地方性氟中毒是我国发病最广、人口最多、病情最重的地方病之一，有病区县1380 个，受威胁人口达1.25 亿［1］。氟中毒除了引起氟斑牙和氟骨症外，一些氟中毒患者常伴有神经系统症状，表现为头痛、头晕、记忆力减退等中枢神经系统功能障碍症状。氟离子可以通过血脑屏障在脑组织中蓄积［2］，氟的反应活性极强，可直接攻击氧，干扰氧代谢，影响抗氧化酶的活性，导致活性氧（ROS）、自由基增多。活性氧与自由基已被认为是氟引起脑损伤的基础。

小胶质细胞是脑组织中的免疫细胞，一些内外因素均可使其激活，活化后的小胶质细胞可通过NADPH 氧化酶（还原型烟酰胺嘌呤二核苷酸磷酸）产生大量的ROS。NADPH氧化酶在小胶质细胞高表达，是催化生成超氧阴离子自由基（O2·-）的主要酶类。本研究以小鼠小胶质细胞（BV-2细胞）为受试对象，通过加入NADPH 氧化酶抑制剂后测定氟处理BV-2细胞ROS产生情况，了解NADPH 氧化酶在氟作用下小胶质细胞ROS产生中的作用，为氟致中枢神经系统损伤机制的研究提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超净工作台（江苏苏净集团公司）；150 型二氧化碳（CO2）恒温培养箱（荷兰Heraeus公司）；倒置显微镜（Nikon公司）；流式细胞仪（FACScan）。氟化钠（NaF，上海生工生物工程有限公司）；MTT（美国Hyclone公司）；NADPH 氧化酶抑制剂API（Santa Cruz Biotechnology 公司）；硝基酪氨酸（NT）试剂盒（北京安必维抗体技术有限公司）。

1.2 细胞培养

小鼠小胶质细胞（BV-2）由中国协和医科大学基础医学细胞中心提供。细胞常规培养于DMEM 高糖培养基（含10%胎牛血清，1×105U／L 青、链霉素），5% CO237℃条件下培养。待细胞达到70%～80%融合时进行1：3传代，本实验细胞采用2d换液，3d传代一次的方法。

1.3 细胞增殖活力的测定

用0.25%的胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10%的胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，将细胞以1×104个／孔的密度接种于96孔板中，每孔体积200μL。将96孔板放入CO2细胞培养箱中继续培养2～3d后，加入浓度为0、1、5、10、25、50、100mg／L 的氟化钠，分别在染毒6、12、48h，加入MTT 溶液，用酶标仪测定各孔吸光度，测定波长为490 nm。细胞活力用MTT 的还原率表示。

1.4 细胞内ROS检测

将细胞以4×104个／mL 的密度接种于6 孔板，于5%CO2细胞培养箱中继续培养2～3d后，加入浓度为0，1，5，10，25，50，100mg／L 的氟化钠，染毒6，12h和24h后加入荧光探针（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式细胞仪对细胞内ROS含量进行检测。对NADPH 氧化酶抑制剂处理的细胞，在细胞生长约60%时，加入100μm NADPH 氧化酶抑制剂API，2h之后加入浓度50mg／L NaF 处理24h，加入荧光探针（DCFH-DA），37℃孵育30min，用流式细胞仪对细胞内ROS 含量进行检测。激发波长488nm，发射波长530nm，以DCF的平均荧光强度表示ROS生成量。

1.5 统计学方法

采用SPSS 13.0for Windows软件进行数据统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，组间两两比较采用LSD 检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氟化钠对BV-2细胞增殖活力的影响

BV-2细胞染毒6h后，100mg／L NaF 染毒组细胞增殖活力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01），但在1和5mg／L NaF处理组，细胞增殖活力出现一个显著升高现象，之后，随染氟剂量的增加细胞增殖活力显著降低；染毒12h后，10、100mg／L NaF染毒组细胞增殖活力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；染毒24h后，1、5、10、100mg／L NaF染毒组细胞增殖活力显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 氟化钠对BV-2细胞增殖活力的影响（±s，n=3）

表1 氟化钠对BV-2细胞增殖活力的影响（±s，n=3）

注：＊与对照组相比，P＜0.05；＃ 与对照组相比，P＜0.01。

2.2 氟化钠对BV-2细胞中ROS含量的影响

BV-2细胞染毒6h后，5mg／L NaF以上染毒组细胞内ROS含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；染毒12h后，10mg／L NaF以上染毒组细胞内ROS含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；染毒24h后，50、100mg／L NaF染毒组细胞内ROS含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 氟化钠对BV-2细胞内ROS含量的影响（±s，n=3）

表2 氟化钠对BV-2细胞内ROS含量的影响（±s，n=3）

注：＊与对照组比较，P＜0.05，＃ 与对照组比较，P＜0.01。

2.3 NADPH 氧化酶对氟化钠暴露的BV-2细胞ROS水平的影响

我们先前的研究已发现氟能引起小胶质细胞ROS水平增加［3］，因此，为检测氟引起的ROS水平增高是否由NADPH 氧化酶引起，我们加入NADPH 氧化酶抑制剂API与氟共同处理小胶质细胞，发现API能够显著降低NaF 诱导的BV-2细胞内ROS含量，见表3。

表3 NADPH 氧化酶抑制剂对氟处理的BV-2细胞ROS含量的影响（±s，n=3）

表3 NADPH 氧化酶抑制剂对氟处理的BV-2细胞ROS含量的影响（±s，n=3）

注：a 与0mg／L NaF染毒组比较，P＜0.01；b 与50mg／L NaF染毒组比较，P＜0.01。API：NADPH 氧化酶抑制剂。

3 讨论

由于神经系统耗氧率高，脑膜富含易氧化的多不饱和脂肪酸，脑组织中的抗氧化酶活性相对比其他组织低，对氧介导的损伤非常敏感。目前多数研究认为，氟诱导的氧化应激是氟引起脑损伤的基础。作为神经系统的免疫细胞，小胶质细胞在正常状态下处于静息状态，当中枢神经微环境发生改变时可激活为活化状态［4］，抵御外来抗原的侵袭，对机体产生保护作用。然而，过度的活化可释放过多的炎性因子和ROS等，引起中枢神经系统损伤［5，6］。NADPH 氧化酶是介导免疫细胞细胞外超氧化物产生的主要酶，在小胶质细胞中高表达。NADPH 氧化酶能够催化氧分子生成超氧阴离子自由基（O2·-）［7］。本研究发现，氟处理组细胞内ROS的含量显著高于对照组，并呈显著的剂量-反应关系。由此可以推测，氟可诱导ROS水平增高，引起氧化应激。API，一种广泛使用的NADPH 氧化酶抑制剂，显著降低了氟引起的小胶质细胞内ROS含量。说明NADPH 氧化酶参与了氟诱导的小胶质细胞氧化应激反应。本研究结果表明氟可降低小胶质细胞活力，引起小胶质细胞氧化损伤，NADPH 氧化酶在氟诱导的ROS产生中起一定作用。

［1］孙殿军.论中国地方病控制之前景［J］.中国地方病学杂志，2009，128（1）：3-6

［2］Vani ML，Reddy KP.Effects of fluoride accumulation on some enzymes of brain and gastrocnemium musule of mice［J］.Fluoride，2000，33（1）：17-26

［3］刘子酉，潘峙宇，王惠惠，等.氟致小鼠小胶质细胞的活化及氧化损伤的研究［J］.环境与健康杂志，2010，27（8）：679-681

［4］TaKao T，Traccy DE，Mitchell WM，et al.Interleukin-1receptors in mouse brain［J］.Characterization and Neuronallocalization Endocrinology，1990，127：3070

［5］Chao CC，Hu S，Ehrlich L，et al.Interleukin-1and tumor necrosis factor-αsynergistically mediate neurotoxicity：involvement of nitric oxide and of N-methyl-Daspartate receptors［J］.Brain Behavior and Immunity，1995，9（4）：355-365

［6］Chew LJ，Takanohashi A，Bell M.Microglia and inflammation：Impact on developmental brain injuries［J］.Mental Retardation and Developmental Disabilities Research Reviews，2006，12（2）：105-112

［7］Gao HM，Liu B，Zhang WQ，et al.Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson＇s disease［J］.FASEB J，2003，17（13）：1954-1956