DNMT3BSNP（-579G／T）与佳木斯胃癌发病风险关联研究

张淑红，朱金玲，张 虎，王茉琳，王长山，金岳雷，张金波

（佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007）

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是指在染色体序列上由于单个核苷酸位置上存在的变异而引起的DNA 序列多态性，且在一个人群中发生频率高于1%。SNP 是一种常见的遗传变异形式，SN P 的存在是导致个体之间、人种之间差异的原因之一。人体内的DNMT 基因呈单核苷酸多态性，发生在启动子区的SNP可影响基因的表达或引起酶活性的改变，并能改变相应的DNMT蛋白的结构和功能［1］，进而与肿瘤的发生机制有着密切的关系。

表观遗传学是研究DNA 序列没有变化，但是产生了可遗传的表达改变，包含DNA 甲基化、基因组印记、染色质组蛋白修饰、隔离蛋白以及非编码RNA 调控等方式。DNA 甲基化是由DNA 甲基转移酶（DNMTs）介导的，目前发现有活性的DNMTs有DNMT1、DNMT3A和DNMT3B。一般认为它们三者是协同作用的，共同使基因组产生新的甲基化型并维持已经形成的甲基化表型。DNMT1 主要参与甲基化状态的维持，并与甲基化状态的延伸有关；DNMT3 包括DNMT3a、DNMT3b，以及DNMT3L 等，DNMT3A和DNMT3B主要是起从头甲基化的作用，而DNMT2的功能尚不明确。DNMT3B在肿瘤的发生中起到重要的作用，研究发现DNA 从头甲基转移酶DNMT3B在膀胱癌，结肠癌，胃癌，肝癌等肿瘤组织中都存在明显的高表达［2］。由于DNA 甲基转移酶在肿瘤发生中起着重要作用，近年来一直受到研究者的青睐。

SNP、DNA 甲基化与肿瘤三者之间的关系就已经有相关报道［3］。研究结果表明DNA 甲基化能产生SNP位点，而SNP位点同样能产生新的DNA 甲基化位点，并可能对相应基因的DNA 甲基化状态有调控作用，影响其功能的发挥，进而影响肿瘤发生和发展的过程。已有的研究结果提示，SNP能够通过DNA 甲基化相关酶类来影响肿瘤发生的易感性。在DNMT3B 基因中也发现了一些SNP位点，尽管这些SNP的功能尚不明了，但其中一些SNP能够影响DNMT3B 的活性，改变人类对肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤的易感性。本研究选择佳木斯地区汉族人群胃癌病例组和正常对照组，探讨DNMT3B 基因启动子区SNP-579G／T位点与胃癌发病易感性之间的关系。

1 材料和方法

1.1 材料

病例组血样选自佳木斯大学附属第一医院、佳木斯市肿瘤医院的胃癌血液样本50例，其中男30例，女20例。血液标本采集前均没有抗肿瘤药物的使用记录。对照组为健康人血液样本60例，男35例，女25例。其中性别、年龄等与病例组相匹配，见表1。两组人群都是佳木斯地区汉族人群，个体之间均无血缘关系，无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 全基因组DNA 提取：采集静脉全血2mL，运用DNA 提取试剂盒提取基因组DNA，分别提取病例组、对照组外周血，4℃保存。

1.2.2 PCR：引物序列如下：上游5’CAGGTCTCATTATGCCTAGG-3’（nt 1533753— 1533772），下 游5’GGGAGCTCACCTTCTAGAAA-3’（1533977—1533958），扩增产物225bp。单管反应体系25μL包含dNTPs 0.1mmol.L-1，上下游引物各10pmol，Taq DNA 聚合酶1.25U，DNA 1.0μL（100ng）。95℃预变性5min；95℃20s，56℃20s，72℃20s共30个循环，最后72℃延伸10min。PCR 产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察。

1.2.3 限制性内切酶pvuⅡ酶切反应：20μL 酶切反应体系含10×Buffer 2.0μL，pvuⅡ（TaKaRa公司）4U，PCR 产物2.0μL，混匀后37 ℃水浴中酶切过夜。酶切产物于2%琼脂糖凝胶电泳分析基因型。

1.2.4 选择凝胶电泳证实为GT 基因型，测序。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行卡方检验，计算P值、the odd ratios（ORS）和95%confidence intervals（CI）。

2 结果

2.1 PCR-RFLP分析DNMT3B基因启动子区SNP位点（-579G／T），PCR 产物225bp，Maker为DL2000，见图1。经限制性内切酶pvuⅡ酶切，酶切产物为132bp和93bp，部分结果见图2。

图1 PCR 产物电泳图1：maker；2～9：PCR 产物

图2 -579G／T 酶切产物图1～5：酶切产物；6：maker

2.2 -579G／T 位点PCR-RFLP 分型结果经测序验证，利用BLAST 与基 因DNMT3B 全 序 列（GeneID：1789 NC000020.9）进行比对，见图3～4。

图3 GT 杂合子测序图

图4 TT 纯合子测序图

2.3 -579G／T 位点在胃癌病例组和正常对照组中基因型分布无显著性差异P＞0.05，见表2，经统计学验证两个群体均为遗传平衡群体。-579G／T 位点与胃癌发病风险估计无统计学意义：P＞0.05，OR（95%CI）=0.65（0.41-1.03）。

表2 DNMT3B（-579G／T）肺癌组和正常对照组基因型和基因频率分布

3 讨论

SNP是指DNA 多态性在人群中的分布频率大于1%的可遗传性的变异。研究表明，位于基因启动子区的SNP 能影响基因的表达或酶的活性［4］。本研究所得DNMT3B基因启动子区多态性位点-579G／T 在病例组中的分布GT 基因型为14%，TT 基因型为86%；正常对照组中GT 基因型为20%，TT 基因型为80%，两者间无显著的统计学差异（P＞0.05，OR=0.65，95%CI为0.41-1.03），该位点与佳木斯地区胃癌的易感性无显著相关性。

DNMT3B基因的SNP 位点与疾病的关联研究已见报道，目前集中在某单个的位点及某些单体型的研究，且各个位点在人群中基因型的分布及SNP位点与疾病的相关性具有民族性、区域性的差异。文献报道表明DNMT3B 启动子区C46359T 的CT+TT 基因型所患肺癌的风险几乎是CC基因型的两倍［5］；Hu等［6］采用PCR-RFLP和DNA 测序的方法，对259例胃癌患者和262 位健康对照人群的DNMT3B启动子区SNP-149C／T和-579G／T 位点进行分析，结果表明，-579G／T 位点与胃癌易感性相关，携带G 等位基因的个体较TT 基因型个体患胃癌的易感性低，且该位点基因型在中国人、韩国人和美国人中的分布不同。由此可说明，基因多态性因人群、种族以及地域分布的不同而存在差异，进而导致不同人群对肿瘤易感性的差异。Srivastava k等［7］研究表明DNMT3B启动子-579G／T 位点与印度北部地区胆囊癌的易感性无显著相关性。Zhensheng Liu等［8］在头颈部鳞状细胞癌的研究中，进行了DNMT3B 启动子区SNP-149C／T和-579G／T 位点分析，结果表明-149TT 基因型与头颈鳞状细胞癌有较高的相关性；-579G／T 对此肿瘤无明显相关性，但两个SNP 共同作用增加了此肿瘤发病的风险。本实验室在前期的研究中表明，DNMT3B基因启动子区多态性位点-149C／T 与本地区肺癌的发生无相关性［9］。在研究DNMT3B基因启动子区-149C／T位点的基础上继续研究-579G／T 位点，也是对DNMT3B 基因的SNP-579G／T 多态性在佳木斯地区基因型分布及其与胃癌发生关系的初步探索，由于样本量不大，再加上有些基因型在人群中的分布比例较小，所以不能完全确定DNMT3B 基因-579G／T 多态性与胃癌的发生无关。需要在此实验基础上继续加大样本进行按吸烟、病情分期、分层来探讨两者间的关系，同时需要做SNP 单体型的研究。至于该基因的SNP位点与其它肿瘤易感性的关系，尚需进行更深入的研究，加以阐明。

［1］宋华梅，黄利鸣，王艳林.哺乳动物DNA 甲基转移酶家族的研究进展［J］.实用医学杂志，2010，265：877-879

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［3］蒋逸群，胡多沙，段芝，等.DNA 甲基化、单核苷酸多态性与肿瘤［J］.国际病理科学与临床杂志，2011，31（6）：499-502

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［6］Hu J，Fan H，Liu D，et al.DNMT3BPromoter Polymorphism and Risk of Gastric cancer［J］.Dig Dis Sci，2009，55（4）：1011-1016

［7］Srivastava K，Srivastava A，Mittal B.DNMT3B-579 G＞T promoter polymorphism and risk of gallbladder carcinoma in North Indian population［J］.J Gastrointest Cancer，2010，41（4）：248-253

［8］Zhensheng Liu，Luo Wang，Li-E Wang.Polymorphisms of the DNMT3bgene and risk of squamous cell carcinoma of the head and neck：a case-control study［J］.Cancer Lett，2008，268（1）：158-165

［9］张淑红，杨琳红，马雪梅，等.DNMT3B 基因SNP（-149C／T）与佳木斯地区肺癌发病风险的关系［J］.中国老年学杂志，2011，31（21）：4090-4091