小型吸虫成虫永久性玻片标本制作技术

戴婷婷，周本江，王 红，张伟琴，郭艳梅

(1山西医科大学汾阳学院病原生物与免疫学教研室，汾阳032200;2昆明医科大学病原生物学系;3昆明医科大学海源学院人体寄生虫学教研室)

医学寄生虫学在我国是医药卫生院校学生必修的一门基础医学课程，属于形态学的范畴。实验教学是形态学科的重要组成部分，实验课的主要内容就是如何把采集到的大体标本制作成能够长期保存和使用的永久性玻片标本。对寄生虫标本进行辨识是医学生培养的重要内容，它将为寄生虫病的诊断、寄生虫病的防治以及寄生虫学的科学研究打下坚实的基础［1］。故寄生虫学实验标本的制作和保存具有重要意义。

寄生于人体的吸虫成虫是寄生虫学实验课中必须观察的重要标本。制作的成虫玻片标本要求能够显示其自然状态下难以观察到的形态结构特征是寄生虫学实验技术难题。传统的标本固定、染色、脱水、透明和封片目前仍是吸虫成虫玻片标本的常规制作方法［2，3］。本实验在常规寄生虫永久性玻片标本制作的基础上，摸索出了并殖吸虫、华支睾吸虫成虫染色标本制作的理想条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体来源 并殖吸虫活体成虫自实验动物模型家猫的肺脏或胸腔获得，华支睾吸虫活体成虫获自家猫的肝胆管内。

1.1.2 主要试剂及其配制 劳氏(Looss)固定液(氯化汞饱和水溶液100 ml，冰醋酸2－4 ml);盐酸卡红染液(卡红粉 4 g，盐酸 2 ml，蒸馏水15 ml，85%乙醇95 ml);1%盐酸乙醇(70%乙醇99 ml，浓盐酸1 ml);3%碘液、梯度乙醇(35%－100%)、二甲苯、中性树胶。

1.1.3 主要仪器 生物体视镜(XTT型实体显微镜)、光学显微镜(2XA850883)。

1.2 方法

将取自实验动物模型的活体成虫置于37℃无菌生理盐水中存放5－10 h，使其子宫内的部分虫卵和消化管中的黑色残留物排出，便于收集虫卵和减少杂质对封片标本的影响［4］。小型吸虫成虫玻片标本的制作步骤如下。

1.2.1 固定 ①压平:取载玻片和盖玻片各一张，在载玻片中央滴加清水，将虫体自盛有生理盐水的培养皿内移至载玻片上，平放在清水中并摆正位置(腹吸盘居中)。将盖玻片轻轻覆盖在虫体表面，用解剖针缓慢轻压，并不断调整虫体姿态，待虫体充分伸展、厚薄适宜、口腹吸盘位置正常、内部主要结构显现为止。②固定:用滤纸片吸干载玻片上多余的水分，从盖玻片边缘缓慢滴入2－3滴劳氏液，并根据需要适时补充固定液，虫体自外缘向中心逐渐发白，待整条虫体完全变白且失去伸缩性后，轻轻移开盖玻片，将初步固定的虫体转入凹皿内，再滴加少量的劳氏液继续固定1－2 h。③终止固定:吸弃劳氏液，用蒸馏水清洗2－3遍。④适应等渗:依次用35%、50%、70%的梯度乙醇浸泡各30 min后，再换一次70%的乙醇。⑤脱汞:在70%乙醇浸泡虫体的凹皿中滴加2－3滴3%的碘液，用滴管吹打均匀，使其成浓茶色即可，留置1－2 d且间歇吹打。⑥脱碘:吸弃碘液，加入70%乙醇洗脱去碘，液体若为茶色，勤换乙醇，轻轻反复吹打，注意千万不能伤及虫体，待虫体颜色完全变白为止。保存在70%乙醇中以备染色。

1.2.2 染色 ①染色:将压平固定、脱汞脱碘处理后的虫体自70%乙醇保存液中移入平皿内，加入盐酸卡红染液以淹没虫体为宜，浸染时间分2，4，6 h 3个组别。②脱色:将染液中的虫体标本移入70%乙醇中冲洗数次，并用滴管不断冲洗虫体直至没有染液析出为止。③分色:将脱色后的虫体移入1%盐酸乙醇中分色，做2，6，10 min的分组试验。分色过程必须在体视显微镜进行，需要密切观察分色的程度。④冲洗:将分色后的标本移入70%乙醇中换洗2次，并用滴管不断冲洗虫体。可暂时保存在80%的乙醇中以备制片。

1.2.3 脱水 把虫体组织内水分逐渐脱净，以便透明和封片。将虫体依次移至80%，85%，90%，95%和无水乙醇内进行梯度脱水，分20，30，40 min三个组别，可随浓度的升高而适当缩短脱水的时间。

1.2.4 透明 将经无水乙醇脱水后的虫体移入二甲苯中透明，分20，25，30 min三个组别。

1.2.5 封片 封片前根据虫体大小选择适宜规格的盖玻片。取经清洁液处理过的洁净载玻片，在其中1/3与右1/3交界处滴加中性树胶(用二甲苯溶解稀释到适宜的黏稠度)2－3滴，将透明满意的虫体从透明液中取出后，迅速从一侧插入树胶中(尽量缩短与空气接触的时间，否则虫体会因吸水而发白)，摆正体位使腹面向上、头端朝下，待树胶浸过虫体，然后用小镊子夹取洁净的盖玻片，由左侧徐徐盖下，即基本完成制片过程。如树胶中有较大的气泡，可用解剖针轻轻挑去，然后平放在防尘托盘内，保存在通风、避光、防震、防潮处或干燥箱内干燥，经鉴定后在玻片的左1/3处贴上记录标签，标注名称(学名和中文名)及虫龄等重要信息。

图1 并殖吸虫成虫口吸盘和卵黄腺Figure 1 Oral sucker and vitellaria of Paragonimus

图2 并殖吸虫成虫腹吸盘和肠支Figure 2 Ventral sucker and intestinal branches of Paragonimus

图3 并殖吸虫黑褐色的子宫内充满虫卵Figure 3 Uterus of Paragonimus(full of eggs)

图4 并殖吸虫一对睾丸Figure 4 A pair of testes of Paragonimus

图5 华支睾吸虫成虫染色标本Figure 5 Adult worm stained samples of Clonorchis sinensis

图6 华支睾吸虫腹吸盘、子宫内充满虫卵Figure 6 Ventral sucker and uterus of Clonorchis sinensis

图7 华支睾吸虫的卵巢、受精囊、睾丸Figure 7 Ovary，spermatheca and testes of Clonorchissinensis

2 结果

2.1 标本处理

对染色、分色、脱水和透明时间等步骤分别进行分组试验处理标本，经过摸索发现，染色时间2－4 h为宜，虫体内部器官呈现深红色。分色时间为6 min时，虫体内各组织器官色差明显、层次清晰，此时虫体外表面为浅玫瑰红色。脱水时间不宜过短，30 min最佳，可将组织内的水分脱净。透明时间30 min为宜，不可过长，待整体完全透明、内脏器官清晰可见即可封片。

2.2 结构观察

本实验技术制作的标本有以下特征:

2.2.1 标本可清晰地看到并殖吸虫成虫的口吸盘呈浅红色，卵黄腺呈现深红色，腺组织发达，分布于虫体的两侧、背面及腹面的两外侧，由口吸盘后缘起直至虫体末端(图1，见第549页)。腹吸盘亦为浅红色和鲜红色的两侧肠支。肠支在食道后分为两支，经3－4个波浪状弯曲伸达虫体亚末端(图2，见第549页)。

2.2.2 标本可见并殖吸虫成虫的子宫团深红色，庞大而明显，子宫管蟠曲成团，内含大量黑褐色虫卵呈颗粒状，密布于子宫内部(图3，见第550页)。2个睾丸玫红色，左右并列于虫体后1/3处，位于肠支之间。睾丸中心体较小，呈长形分叶状，分叶长短粗细不一，分3－5叶，分叶末端常有膨大(图4，见第550页)。

2.2.3 华支睾吸虫成虫虫体半透明、狭长、扁平，状似葵花籽，前端较窄，后端钝圆(图5，见第550页)。雌性生殖器官有1个分叶状的卵巢呈玫红色，受精囊淡红色、椭圆形，位于卵巢的斜后方。棕色子宫位于卵巢与淡粉色的腹吸盘之间，其内充满黑褐色虫卵。雄性生殖器官有1对紫红色分支状睾丸，前后排列在虫体后1/3处。棕黄色的卵黄腺滤泡状，分布于虫体中段两侧(图6、7，见第550页)。

3 讨论

小型吸虫，如并殖吸虫、华支睾吸虫成虫的永久性玻片标本的制作过程一般包括固定、染色、脱水、透明和封片五个主要步骤，各步骤间环环相扣，任何一个环节被疏忽都会影响到整个标本的制作效果。固定的目的是防止生物标本的组织细胞自溶或腐败，是制作标本最基础的一步。标本固定应选择活的成虫，死亡后固定效果差，并且会影响到后面的染色。本实验选择劳氏液固定虫体，是基于冰乙酸有克服单纯固定液容易引起虫体收缩的作用，劳氏液可凝固蛋白质，也可较好地固定胞质和胞核，并可使虫体充分伸展［5］。

染色是标本制作的重要环节，决定着标本的质量。最佳效果是经过染色后的虫体不同部位、不同组织间呈现出一定的色差，这样才有利于观察寄生虫的形态和结构［6］。标本染色后必须使用脱水剂将组织内的水分脱尽，才有利于组织的透明和玻片标本的保存。否则，寄生虫组织内的水分能分解组织、阻止透明剂的渗入和油溶性的封片剂混合。脱水是从低浓度乙醇到高浓度乙醇逐级进行，缓慢地将组织内的水分吸出，反之易引起组织强烈的收缩而变形，直接影响到生物标本的内部结构和形态，不利于标本的观察和鉴定。但高浓度乙醇很容易使染好的标本变脆，故浸泡时间不宜太长。标本经脱水后体内仍可能存在一些杂质，会影响到光线的穿透。必须放置在透明剂(二甲苯)中透明，通过改变标本的折光率，从而使更多的光线能够透过组织，便于显微观察和封片永久保存。封片是标本制作的最后一道工序，需要使用封固剂。封固剂一般使用加拿大树胶或中性树胶(neutral balsam)，后者为国产天然树胶，浅黄色透明液体，一般购置后即可使用。若过于黏稠可加入适量的二甲苯稀释，过稀时打开瓶盖放置在37℃烤箱中一定时间即可。中性树胶不溶于水，干燥后形成无色透明固体，牢固地黏附在盖玻片与载玻片之间，能够隔绝被封固的标本与外界空气接触，避免标本受潮、干裂和被氧化而褪色，虫体不会出现收缩变形等现象，有利于标本长期保存。

吸虫标本制作质量的好坏亦与工作经验有着很大的关系。具体到不同虫种，其实际操作步骤有所不同［7］。标本制作方法关键在于:①标本固定过程中压得越平整其细微结构越清晰，但切勿压破。至于是否加压固定视虫体大小厚薄而定，并殖吸虫和华支睾吸虫的成虫个体较小，只需轻压成形即可。②染色及分色依虫体大小与厚薄而定，并殖吸虫成虫比华支睾吸虫厚，则染色和分色的时间稍长。分色结果决定着染色的成败，分色要恰到好处，颜色不能过深也不能过浅，要在生物体视镜下密切观察，一直分到各内脏器官色度适宜为止。③脱水必须充分彻底，时间视标本的大小厚薄而定。如果水分不能完全脱尽，则不易透明，若在封片时的透明剂内出现白色混浊现象，需重复脱水。虫体脱水后较硬易碎，最好用小勺移动虫体，并且一定要轻拿轻放，否则易损坏虫体结构，令制片过程夭折。④透明时间30 min即可，时间太长标本变得很脆，不易封片。⑤封片时中性树胶的量要恰到好处，过多影响美观，过少易产生气泡，且使虫体与空气接触而发白。操作时，将盖玻片稍倾斜使其一侧先与树胶接触，再缓慢地将其放下，尽量减少或避免气泡产生。若树胶液不足以覆满标本，可从盖玻片边缘补充，但需要注意避免虫体移位。一般标本与盖玻片四边的距离约为2 mm，太靠边缘标本易受空气中酸的作用而褪色，甚至损坏。

高质量的标本用于教学，学生容易在显微镜下观察到虫体内部的细微结构，能使理论教学与实验观察有机地结合起来，不仅减轻了带教老师的工作强度，还能有效地提高实验教学课的教学效果。本实验标本的制作技术对传统的制作方法进行了改进，通过对染色、分色、脱水和透明时间等步骤分别进行分组试验处理，摸索出了小型吸虫成虫永久性玻片标本制作的最佳条件，是理想的寄生虫学教学标本和科研标本制作的实验技术。运用本方法制作的并殖吸虫、华支睾吸虫成虫玻片标本形态逼真、色泽鲜艳、内部结构清晰、组织器官层次分明、长期保持不褪色。不仅能够延长保存时间，而且能够显示出其自然状态下的重要形态结构，如吸盘、消化系统、生殖系统等结构特征清晰可见，是鉴定寄生虫虫种的重要基础［8，9］。

［1］赵辉元.家畜寄生虫与防制学［M］.长春:吉林科学技术出版社，1996:7.

［2］World Health Organization.Basic Laboratory methodsin medical Parasitology［M］.Geneva:World Health Organisation，1991:1－122.

［3］陈兴保，吴观陵，孙新，等.现代寄生虫病学［M］.北京:人民军医出版社，2002:1－3.

［4］沈一平.实用肺吸虫病学［M］.2版.北京:人民卫生出版社，2008:231－232.

［5］李朝品.人体寄生虫学实验研究技术［M］.北京:人民卫生出版社，2008:7－13.

［6］Chen PH，Kong DF，Li HZ，etal.The experimental technique of human parasitology［M］.Beijing:Scientific Publishers，1988:9－17.

［7］肖芳萍.不同保存期吸虫标本胭脂红染色时间的比较［J］.中国兽医科技，2002，32(7):41－42.

［8］陈佩惠，孔德芳，李慧珠，等.人体寄生虫学实验技术［M］.北京:科学出版社，1988:6－7.

［9］堵南山.无脊椎动物玻片标本制作法［M］.上海:上海科学技术出版社，1961:36－81.