微量接触DNA的浓缩与回收

徐 程，丰 蕾，杨 帆，涂 政，胡 兰#

(1中国人民公安大学刑事科学技术学院，北京 100038;2公安部物证鉴定中心，法医遗传学公安部重点实验室;*通讯作者，E-mail:fengleink@163.com;#共同通讯作者，E-mail:hulan328@yahoo.com)

目前，要求对微量生物检材进行DNA检验的案件数量呈上升趋势，这些检材在很多情况下是案件的唯一物证。因此，如何高效地对微量检材进行DNA检验，成功获得正确的STR分型，成为法医学工作面临的难题［1］。

从微量检材(如渗透性载体上的指纹)获得足够浓度的高质量DNA，是成功进行STR分型的前提。通常，对微量、疑难生物检材的检验，多采用磁珠法如M48纯化试剂盒［2］等尽可能多地提取DNA。Vandewoestyne等［3］采用Amicon离心超滤管对各种微量DNA进行浓缩纯化，对于Chelex提取的DNA纯化效果明显。然而，尽管经过前期纯化，部分检材仍无法获得可靠的STR分型。对M48纯化试剂盒提取后的DNA体积(30μl)较小，Amicon离心超滤管也无法用于DNA的浓缩。本研究通过对已经过纯化后的微量DNA进行进一步纯化、浓缩，提高了疑难微量检材(白纸上的汗潜指纹)DNA的检出率，成功获得样本STR的准确分型。

1 材料与方法

1.1 样本收集

①分别采集3名健康志愿者的口腔拭子(a)，血液(b)，精斑(c)。常温晾干备用。②三名志愿者手指(未洗手)在白纸上按压10 s，采集汗潜指纹24枚。

1.2 主要试剂和仪器

M48纯化试剂盒(Qiagen公司，德国);Amicon离心超滤管(Millipore公司，美国);DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒(ZYMO RESEARCH公司，美国);Identifier®试剂盒(AB公司，美国);高速台式离心机(Thermo，美国);NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo，美国);9700型PCR扩增仪(AB公司，美国);ABI3130XL遗传分析仪(AB公司，美国)。

1.3 DNA提取及样本的制备

将检材 a，b，c用 M48纯化试剂盒(Qiagen，德国)，参考使用手册，提取DNA样本。

将Identifier®试剂盒AmpFLSTR Control DNA 9947A(AB公司，美国)以及M48纯化试剂盒提取的DNA样本，采用NanoDrop 2000超微量分光光度计(Thermo，美国)按照操作手册，对DNA的浓度进行定量。

参考定量结果，分别稀释9947A、口腔DNA、血液DNA和精斑DNA，经计算终浓度约为20 pg/μl。

1.4 模板DNA的纯化与浓缩

1.4.1 DNA Clean ＆ ConcentratorTM－5试剂盒纯化 将稀释后的DNA样品各吸取30μl(模拟M48提取后，回收DNA常规体积)，采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒(ZYMO RESEARCH公司，美国)，在DNA中加入60μl(2∶1)结合液，经过纯化柱13 000 r/min离心30s，加入200μl洗涤液13 000 r/min离心30 s，重复一次。最后将过滤管放入新的EP管中，在过滤膜中心加入6μl超纯水(65℃)，孵育1 min，13 000 r/min离心30s回收 DNA。回收后的DNA总体积为6μl，每个样本重复检验10次。

1.4.2 Amicon离心超滤管纯化 将稀释后的DNA样品各吸取30μl(模拟M48提取后，回收DNA常规体积)，加入Amicon离心超滤管(Millipore公司，美国)内管，13 000 r/min离心10 min，再将过滤管取出倒置放入新的EP管中，1 000 r/min离心3 min回收DNA，回收后的DNA总体积为20μl，每个样本重复检验5次。

1.5 扩增及电泳

将稀释前的DNA模板，以及经过稀释后分别选用两种方法纯化的DNA样本，在9700型PCR扩增仪(AB公司，美国)上，应用Identifier试剂盒(AB公司，美国)扩增。体系为:PCR Reaction Mix 4.2 μl，Primer Mix 2.2 μl，AmpliTaq Gold DNA Polymerase:0.2 μl，H2O 3.3 μl。扩增条件为:95℃ 11 min→(94℃ 1 min→59℃ 1 min→72℃1 min)×28个循环→60℃ 60 min→4℃保存备用。AmpFLSTR Control DNA 9947为阳性对照，选取纯水作为阴性对照。

DNA扩增产物1μl，加入10μl loading buffer(高纯度去离子甲酰胺和LIZTM－500内标的混合物，混合比例为50∶1)中，然后在3130XL遗传分析仪上进行毛细管电泳。

1.6 指纹DNA检验

分别剪取24枚含有指纹的白纸，用M48纯化试剂盒(Qiagen，德国)提取DNA样本，按照1.5所述对样本进行扩增及电泳。

吸取30μl M48提取后的指纹DNA，采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒纯化提取后的DNA，按照1.5所述对样本进行扩增及电泳。

1.7 数据分析

采用Genemapper ID X软件进行数据分析，检测荧光强度RFU(Relative Fluorescence Units)阈值设为50。稀释前的DNA样品的STR分型结果为已知分型结果。将纯化后STR分型图谱与已知分型结果进行比对，其中以获得9个以上基因座的明确分型为有效分型。所有数据均采用IBM SPSS 20软件，对数据进行Fisher确切概率检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 纯化前STR分型图谱Figure 1 STR profile before purification

图2 Amicon纯化后STR图谱分型及峰面积Figure 2 STR profile and peak area after purified by Amicon Utral

图3 DNA Clean＆Concentrator TM－5试剂盒纯化后STR图谱分型及峰面积Figure 3 STR profile and peak area after purified by DNA Clean＆Concentrator TM－5 kit

2 结果

2.1 稀释后DNA的分型结果

比较两种方法纯化后STR分型图谱每个基因座上等位基因的峰高、峰面积及等位基因丢失率的结果显示:经过Amicon超滤离心管浓缩后，获得的DNA体积约为20μl，浓缩倍数约为1.5倍(见表1);经过STR分型，平均峰高为85.3RFU，平均峰面积为1 130.8，等位基因丢失率为66.13%。而采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒对样本DNA进行浓缩后，获得DNA体积为6μl，体积浓缩倍数为5倍。经过电泳分析，样本的平均峰高为147.5 RFU，平均峰面积为1 960.2，等位基因丢失率为35.14%。

表1 两种浓缩方法浓缩效果的比较Table 1 Comparison of concentrated effects between two methods

将STR分型图谱与已知分型结果进行比对，其中以获得9个以上基因座的明确分型为有效分型。Amicon超滤离心管对微量DNA的纯化后检验效果低于DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒，结果见表2。

表2 Amicon超滤离心管，DNA Clean＆Concentrator TM－5试剂盒STR检测结果Table 2 The STR detection results by Amicon Ultra and DNA Clean＆Concentrator TM－5 kit

经过M48试剂盒提取后稀释的DNA，未经过浓缩直接扩增检验，无法获得明确的STR分型结果，分型图谱见图1(见第551页)。将提取后的30μl DNA经过Amicon试剂盒浓缩后，仅获得个别位点的STR分型，且峰高较低，分型结果不利于判断(图2，见第551页);经过DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒浓缩后，可以获得完整的STR分型图谱，并且与稀释前DNA分型一致(图3，见第552页)。

2.2 汗潜指纹的检验结果

汗潜指纹M48提取的DNA，采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒纯化浓缩，结果显示，可以提高接触DNA的检出率(见表3)。

3 讨论

表3 汗潜指纹STR分型DNA Clean＆Concentrator TM－5纯化前后检验结果Table3 The STR results of fingerprints before and after concentrated by DNA Clean＆Concentrator TM－5 kit

根据Peter Gill对于低模板DNA的定义，模板量低于100 pg的样本被称为微量DNA［4］。针对接触检材等微量检材的检验，通常通过以下多种方法来提高检验的成功率。①DNA提取可以选用磁珠法代替Chelex100法提高DNA提取量［5］;②可以通过纯化试剂盒对提取的DNA进行进一步的纯化［3］;③在进行DNA扩增时，通过缩小PCR扩增体系的总体积或者适当增加循环次数［6，7］也能提高检验成功率。然而，尽管有上述的多种方法，实际案件中仍不乏有经过上述处理后，仍然无法得到正确STR分型的例子。

参考Identifiler®Kit的使用手册，建议进行扩增前，应该对模板DNA进行定量，扩增体系中加入反应的模板量范围为0.5－1.25 ng。低于该检测下限的DNA检测效果不佳。本实验将样本DNA的浓度稀释到试剂盒的检测下限以下，通过计算浓度约为20 pg/μl。通过增加模板DNA输入体积、增加循环参数等方法，均难以得到有效的STR分型图谱。

目前，对DNA进行纯化有许多不同的方法。M48纯化试剂盒对模板DNA进行纯化的基本原理是磁珠法，利用顺磁性颗粒(PMP)在高盐离子存在下结合核酸，低渗下释放核酸的原理，在磁场作用下，将磁性颗粒与液体分开，提取纯化DNA样品。Amicon离心超滤管采用的是复合再生纤维素超滤膜，利用超滤膜不同孔径的微孔，将比其孔径小的分子，如水等滤过掉［8，9］，从而在内管中获得浓缩、纯化后的样品DNA。Amicon已经应用于法医学中，对微量 DNA、游离 DNA进行纯化。Vandewoestyne等［3］针对 Chelex－100 提取后的游离 DNA，采用Amicon超滤管对500μl的DNA进行浓缩。但是对于体积较小的样本，不适合选用该方法进行纯化。根据使用手册，Amicon超滤管对模板DNA浓缩后，回收体积为20μl。通常，M48纯化后回收的DNA体积为30μl，采用Amicon进一步纯化仅能浓缩1.5倍，其效果不明显。

DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒可以将低体积的DNA，在DNA Binding Buffer的作用下，与纯化管内膜进行高效特异性结合。通过洗涤，可以有效去除各类酶、荧光染料、游离dNTP等杂质。随后利用DNA的亲水性回收DNA。DNA回收体积为6μl，将样本浓缩5倍以上，DNA回收率根据片断大小不同，10 kb以下DNA回收率可达90%，而超过11 kb的大片断DNA回收率可达70%。已有研究采用DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒应用于对PCR产物进行DNA的纯化［10］，也有研究将该试剂盒应用于表观遗传学的DNA回收［11］。但是，目前该试剂盒尚未应用于法医学中。本实验可将DNA样本的浓度浓缩到 0.1 ng/μl，明显提高了PCR扩增的模板DNA量。通过汗潜指纹的检验，可以得出，针对接触DNA的检验，对DNA进行浓缩可以有效提高STR分型的检出率，为案件的侦破提供一定信息。

DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒操作简便、省时，通过DNA结合、洗涤、回收三个步骤，可以在3 min内实现对样本的浓缩回收，比Amicon浓缩需要的时间缩短了5倍，而浓缩的效果却明显高于Amicon法。其价格便宜，更适合于在基层推广应用。由此可见，DNA Clean＆ConcentratorTM－5试剂盒对于纯化后微量DNA的浓缩回收，在法医学中可以作为纯化后DNA的补充检验手段，来提高检出率。

［1］杨电，刘超，徐曲毅，等.DNA IQ磁珠法结合Maxwell 16自动仪提取接触DNA进行STR检验［J］.刑事技术，2011，(3):3－5.

［2］杨电，张丽萍，刘超，等.Chelex法和两种磁珠法提取接触DNA效果的比较［J］.刑事技术，2012，(1):11－13.

［3］Vandewoestyne M，Hoofstat DV，Franssen A，etal.Presence and potential of cell free DNA in different types of forensic samples［J］.Forens Sci Int Genet，2013，7(2):316－320.

［4］Gill P，Whitaker J，Flaxman C，etal.An investigation of the rigor of interpretation rules for STRs derived from less than 100 pg of DNA［J］.Forens Sci Int，2000，112(1):17－40.

［5］王彦涛，宋道江.M48磁珠法和Chelex－100法提取脱落细胞DNA的初步比较［J］.刑事技术，2013，(2):53－54.

［6］Gill P.Application of low copy number DNA profiling［J］.Croat Med J，2001，42(3):229－232.

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［8］郑秀芬.法医DNA分析［M］.北京:中国人民公安大学出版社，2002:58－59.

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