大承气汤促胃肠动力的研究

关 波，秦 明，张明鑫，刘震雄，张 超，王景杰

(第四军医大学唐都医院消化内科，西安 710038;*通讯作者，E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

功能性消化不良、腹胀、便秘等胃肠动力障碍性疾病属于临床常见病多发病，它严重影响患者的生活质量。近年来中医药治疗胃肠动力障碍性疾病日益受到关注，由于其作用机制不清，进而导致其在临床应用方面的限制。张仲景的大承气汤是一个经典的“通便泻热”组方，“通便泻热”也是该方最为重要的立意，大承气汤其主证可归纳为“痞、满、燥、实”，与现代医学的促胃肠动力为异曲同工，然而大承气汤促胃肠动力作用机制不清，进而限制了中药在临床上的应用。

我们的前期研究发现原位于呼吸中枢和心脏传导系统中具有慢波起搏性质的胃肠动力起搏细胞Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICCs)上的超极化激活性环核苷酸门控性阳离子非选择性通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation nonselective channel，HCN)在胃肠道上具有广泛的分布，且前期我们证明其可能为胃肠道动力起搏的重要离子通道［1－5］。那么大承气汤促胃肠动力作用是否也与HCN1存在明显关系，目前未见明确报道。

1 材料和方法

1.1 大承气汤组方

按照大黄12 g，厚朴15 g，枳实12 g，芒硝9 g组方进行药物煎制。煎制好的药物装瓶冷藏备用。

1.2 动物分组及给药

取成年雄性SD大鼠40只，用随机表法将其随机分成两个组分别做胃肠电检测和免疫荧光检测。各实验随机分为4个组(n=5):正常组，生理盐水组(灌胃给予等体积生理盐水)，大承气汤组，ZD7288(HCN1的特异性阻断剂)+大承气汤组。阻断剂组在麻醉大鼠前2 h，经大鼠尾静脉给予HCN1的特异性阻断剂ZD7288(0.5 mmol/L)干预;由第四军医大学动物中心提供，体重(250±20)g(动物合格证号:SCXK(军)2002—005)。将大鼠置于安静、温暖(20℃)、避光环境中饲养。灌胃给予药物量为前期预实验胃动力变化最大组剂量(1 ml/kg，每毫升大承气汤折合生药57 g)。

1.3 主要实验仪器、抗体及试剂

超低温冰箱(－80℃)(美国NUAIR公司);振荡切片机(日本DOSAKA公司);Confocal激光共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司);兔抗C－KIT多克隆抗体1∶1 000稀释液、鼠抗HCN1单克隆抗体1∶500稀释液、1∶500 羊抗兔FITCC－KIT、1∶500 驴抗兔IgG(均购自美国SIGMA公司);1∶500驴抗鼠Texas red HCN1(MOLECULAR PROBES公司);1∶2 000鼠抗C－kit抗体(CHEMICOM公司)和1∶2 000兔抗HCN1抗体(CHEMICOM公司)等。

1.4 实验标本的处理、检测

1.4.1 取材和固定 将10只SD大鼠在40 mg/kg戊巴比妥钠麻醉下，开胸经左心室至升主动脉插管，先以100 ml生理盐水冲洗血液，随后用冷的(4℃)含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PB，pH 7.4)先快后慢灌流固定2 h。取胃的底、体交界1/3处、空肠置于300 g/L蔗糖中(4℃)直至组织沉底，恒冷箱切片机切制连续冠状切片，片厚30μm，切片分套，置于0.01 mol/L PBS中存放。

1.4.2 免疫荧光化学标记 切片在0.1 mol/L PBS中漂洗后，放入含0.3%Triton X－100的0.1 mol/L PBS中浸泡30 min(室温)。然后进行免疫组织化学荧光染色:①分别入兔抗C－KIT多克隆抗体稀释液(1∶1 000)、鼠抗 HCN1 单克隆抗体稀释液(1∶500，美国Sigma公司)，孵育24 h(室温);②加入结合了荧光素的二抗:羊抗兔FITC(1∶500)C－KIT;驴抗鼠Texas red(1∶500)HCN1，避光孵育 2 h(室温)。0.01 mol/L PBS洗3次后，80%甘油封片后，将实验组和对照组的切片各取10张，在Confocal激光共聚焦显微镜下观察采图。Cajal间质细胞呈网格样，染色呈黄褐色荧光，HCN1染色呈橘红色荧光。

1.4.3 胃电及空肠MMC检测 胃电活动统一参数设定为“生物电，25 mV，直流，30 Hz”，将所记录的胃电生理图频率和波幅进行统计学分析;空肠MMC统一参数设定为“频率100 Hz，时间常数为0.01 s，高频滤波1 kHz，对所记录的周期，活动期/周期(%)和每分钟快波数进行统计学分析。

2 结果

2.1 大承气汤对胃肠动力的促进作用及ZD7288对其作用的影响

实验结果显示，大承气汤对大鼠胃电及小肠MMC有显著影响，大承气汤灌胃组与正常组，生理盐水组相比存在统计学差异(P＜0.05);当给予HCN1受体阻断剂ZD7288，大承气汤的促胃肠动力作用即胃电以及小肠的MMC呈现显著降低状态，ZD7288+大承气汤组与正常组，生理盐水组存在统计学差异(P＜0.05)，且与大承气汤灌胃组相比差异更为显著(P＜0.01，见表1、2)。

表1 大承气汤对大鼠胃电活动影响(n=5，±s)Table 1 Effect of Dachengqi decoction on gastric electrical activity(n=5，±s)

表1 大承气汤对大鼠胃电活动影响(n=5，±s)Table 1 Effect of Dachengqi decoction on gastric electrical activity(n=5，±s)

与正常组和生理盐水组比较，*P＜0.05;与大承气汤组比较，#P＜0.01

大承气汤组 5.90±0.5 1.06±0.10*ZD7288+大承汤组 2.42±0.39*# 0.41±0.03*#

表2 大承气汤对大鼠小肠MMC的影响(n=5，±s)Table 2 Effect of Dachengqi decoction on MMC in rats(n=5，±s)

表2 大承气汤对大鼠小肠MMC的影响(n=5，±s)Table 2 Effect of Dachengqi decoction on MMC in rats(n=5，±s)

与给药前比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;给药后与大承气汤组比较，#P＜0.05

给药后 10.32±5.01* 41.35±4.56* 188.49±15.26*ZD7288+大承气汤组 给药前 16.89±3.17 30.18±4.19 117.22±14.28给药后 37.65±4.89＊＊# 13.51±4.55＊＊# 77.45±10.52＊＊#

2.2 大承气汤对HCN1的表达及ZD7288对其作用的影响

实验结果显示，大承气汤对大鼠胃及小肠黏膜中的HCN1的表达具有显著激活作用(图1，2，见第546页)，大承气汤组荧光光度值与正常组和生理盐水组的荧光光度值相比存在统计学差异(P＜0.05，见图3，4);当给予HCN1受体阻断剂ZD7288，大承气汤对HCN1的激活作用呈现显著降低状态，ZD7288+大承气汤组与正常组和生理盐水组的荧光光度值存在统计学差异(P＜0.05)，ZD7288+大承气汤组荧光光度值与大承气汤灌胃组荧光光度值相比差异更为显著(P＜0.01，见图3，4)。

图1 大承气汤对胃黏膜中HCN1的激活作用Figure 1 Promotive effect of Dchenqi decoction on HCN1 in gastric mucosa of rats

图2 大承气汤对小肠黏膜中HCN1的激活作用Figure 2 Promotive effect of Dchenqi decoction on HCN1 expression in intestinal mucosa of rats

图3 大承气汤对胃黏膜中HCN1激活作用的荧光光度值比较Figure 3 Effect of Dchenqi decoction on fluorescence value of HCN1 in gastric mucosa of rats

图4 大承气汤对小肠黏膜中HCN1激活作用的荧光光度值比较Figure 4 Effect of Dchenqi decoction on fluorescence value of HCN1 in intestinal mucosa of rats

3 讨论

大承气汤是我国传统中医常用的药物，是通里攻下法的代表方剂，出自《伤寒论》，主治以痞、满、燥、实为主症的阳明腑实证，中医认为其病理机制系由寒邪实证，其系由寒邪传阳明之腑，入里化热，与肠中燥屎相结，阻塞肠道，腑气不通所致［6］。大承气汤由大黄、芒硝、厚朴、枳实组成。方中以大黄、芒硝泻下通便，荡涤肠胃邪热积滞，以治燥实，辅以厚朴、枳实行气散结，导滞消痞，以治痞满［6］。四药相和，泻下行气并重，共奏峻下热结之功。现代临床将其用于急性肠梗阻、急性胰腺炎、急性胆囊炎等急腹症的治疗，通里攻下是其关键。大量的临床观察及临床试验表明大承气汤对正常及不同病理状态下的胃肠运动均有明显促进作用［7－9］。本研究发现，大承气汤对胃电活动有非常明显的影响，它可以显著增强胃电活动的幅度与频率，并且在我们前期预实验发现其存在剂量依赖性而且其促动力作用在这些方面与吗丁啉相当，从而增强胃的蠕动。提示大承气汤能增强胃的排空能力。通过我们观察大鼠小肠的MMC的变化情况我们发现，大承气汤明显改善了大鼠小肠的MMC，进一步提示了大承气汤的促胃肠动力作用。

另外，本研究采用了阻断技术后观察到，当给予胃肠动力起搏细胞ICC上离子通道HCN1的特异性阻断剂ZD7288后再给予大承气汤，实验大鼠的胃电活动及小肠的 MMC均产生显著的降低，提示HCN1是大承气汤的作用靶点，这为进一步探讨大承气汤的作用机制提供了理论依据。

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