龟羚帕安丸对帕金森病大鼠模型多巴胺能神经元凋亡影响的研究*

孟 毅，乔明亮，宁亚红，常学辉

(1．河南中医学院第二附属医院，河南 郑州450002; 2．河南中医学院2012 级硕士研究生，河南郑州450046)

帕金森病(Parkinson's dieses，PD)是以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势异常为主要表现的神经系统变性疾病。随着现代社会人口老龄化，PD 发病率有逐年增高的趋势，治疗上多以左旋多巴替代性疗法和对症治疗为主，但长期服用会致不良反应日趋严重。中医学对帕金森病的认识有悠久的历史，对帕金森病的治疗经验亦颇丰。龟羚帕安丸是赵国华教授的经验用方，对帕金森病的治疗有显著疗效［1］。本研究拟通过实验的方法探讨龟羚帕安丸治疗帕金森病的作用机制，为其治疗帕金森病提供理论依据。

1 材料与方法

1．1 动 物

SD 大鼠，SPF 级，雄性，体质量(200 ±20)g，由河南省实验动物中心提供，动物许可证号SCXK(豫)2010－0002。饲养条件:在河南省中医院中心实验室〔使用许可证为SYXK(豫)2011－0002)〕饲养，SPF 级饲料，IVC 大鼠独立通风饲育盒，温度18～26 ℃，湿度40%～70%。

1．2 药品、试剂与仪器

龟羚帕安丸，由龟板、羚羊角、全蝎、威灵仙、厚朴等组成，为河南省中医院院内制剂，批号20130511。美多芭(多巴丝肼片)，上海罗氏制药有限公司产品，批号SH1652。6－羟基多巴胺(批号SLBF550V)、阿扑吗啡(批号SLBF6369V)，均购自美国Sigma 公司。细胞凋亡试剂盒(批号09F20C)、兔抗 Bax (批 号 08G19B)、兔 抗 Bcl-2 (批 号08H12D)、DAB 显色试剂盒(批号130304)、PBS 缓冲液(批号130617)，均由武汉博士德生物工程有限公司提供。大鼠脑立体定向仪，美国Stoelting 公司产品;牙科钻、5 μL 微量进样器，均为上海安亭微量进样器厂产品;Olympus 光学显微镜，产地日本。

1．3 模型的建立

参照周厚广等［2］帕金森病大鼠模型的建立。将SD 大鼠适应性喂养1 周，进行反复行为检测，选择无旋转行为的作为实验对象。随机分为假手术组、实验组和正常对照组。实验组采用以下方法造模:①脑立体定向仪定位。称大鼠体质量;以35 g/L水合氯醛8 μL/g 腹腔注射麻醉;以严格颅平位(前囟与后囟水平高度相差0．1 mm 以下)将大鼠固定于大鼠脑立体定向仪上;常规消毒，备皮;沿正中线切开头皮，剥去骨膜，露出前后囟，参照文献［3］确定左侧黑质致密部(SNC)﹝(前囟后(5．0 ±0．2)mm，矢状缝左侧(1．7 ±0．1)mm，颅骨表面下(7．6 ±0．1)mm﹞，用牙科钻小心钻透颅骨。②微量进样器注射。按确定坐标将微量进样器按1 mm/min的速度缓慢进针到预定深度;注入6-OHDA(溶于含质量分数0．2 g/L 抗坏血酸的生理盐水4 μL 中)8 μg，注射速度为1μL/ min;留针30 min;缓慢(1 mm/min)退针。术后用牙科胶覆盖钻孔，常规缝合伤口，连续3 d 腹腔注射青霉素10 万U/kg 预防感染。

假手术组只注射含0．2 g/L 抗坏血酸的等量生理盐水，其余条件与造模手术相同。术后10 d 开始行为检测，以阿朴吗啡(Apomorphine，APO)按0．5 μg/g 体质量腹腔注射，观察其行为变化。若大鼠恒定转向右侧，且旋转圈数＞7 r/ min，则视为成功PD 大鼠模型;若大鼠不出现旋转、旋转方向不恒定、恒定转向左侧或恒定转向右侧但速度较慢(＜7 r/min)，则视为不成功PD 模型。

1．4 动物分组与给药

将造模成功的PD 大鼠随机分为模型对照组、美多巴组和龟羚帕安丸大、中、小剂量组5 组。分别每日管饲同等容积的生理盐水、美多芭10 μg/(g·d)、龟羚帕安丸4．0 ，2．0，1．0 g/(kg·d)。另设假手术组，常规饲养，每日管饲同等容积的生理盐水。1 d 1 次，共30 d。

1．5 检测指标

1．5．1 取 材

实验结束后，取每组动物进行心脏灌注固定:以35 g/L 水合氯醛8 μL/g 给予深度麻醉后打开胸腔，暴露心脏;经左心室行主动脉灌注固定，先用生理盐水200 mL 进行预灌注，灌注速度由快转慢，直到从右心耳流出的液体变清亮，再用40 g/L 多聚甲醛200 mL 灌注，当见到大鼠双后肢抽搐，尾部变黄，表示灌注完成。完整剥取脑组织，分离出中脑黑质，在同一固定液中4 ℃固定4～6 h。

1．5．2 黑质TUNEL 阳性细胞数

采用TUNEL 法观察。常规石蜡包埋，切片，片厚为5 μm，按试剂盒方法操作。

1．5．3 Bax、Bcl-2 阳性细胞数

采用免疫组化法检测。采用抗生物素－ 生物素－ 过氧化物酶复合物(ABC)法，按试剂盒方法操作。在光镜高倍镜下随机取4 mm2视野，计算染色阳性细胞数。分析软件使用IMS 彩色图像分析系统软件。

1．6 统计学方法

采用SPSS 13．0 统计分析软件处理。数据以均数()±标准差(s)表示，多样本组间比较采用方差分析。以P＜0．05 为差别有统计学意义。

2 结 果

与假手术组对比，模型对照组大鼠黑质细胞凋亡阳性细胞数及Bcl-2、Bax 阳性细胞数升高，Bcl-2/Bax的比值下低，差别有统计学意义(P＜0．01)。与模型对照组对比，龟羚帕安丸大、中、小剂量组及美多芭组大鼠黑质细胞凋亡阳性细胞数及Bax 阳性细胞数降低，Bcl-2 阳性细胞数及Bcl-2/Bax 的比值升高，差别有统计学意义(P＜0．01)。与美多芭组对比，龟羚帕安丸大剂量组Bax 阳性细胞数降低，Bcl-2/Bax 的比值升高，差别有统计学意义(P＜0．05 或P＜0．01);大鼠黑质细胞凋亡阳性细胞数、Bcl-2 阳性细胞数对比，差别无统计学意义(P＞0．05)。与龟羚帕安丸中、小剂量组对比，大剂量组大鼠黑质细胞凋亡阳性细胞数及Bax 阳性细胞数降低，Bcl-2阳性细胞数及Bcl-2/Bax 的比值升高，差别有统计学意义(P＜0．05 或P＜0．01)。见表1。

表1 各组大鼠黑质TUNEL 阳性细胞数、Bcl-2、Bax 阳性细胞数及Bcl-2/Bax 对比 个，±s

表1 各组大鼠黑质TUNEL 阳性细胞数、Bcl-2、Bax 阳性细胞数及Bcl-2/Bax 对比 个，±s

注:与假手术组对比，＊＊＊P ＜0．01;与模型对照组对比，### P ＜0．01;与美多芭组对比，△P ＞0．05，△△△P ＜0．01;与龟羚帕安丸中剂量组对比，＊＊＊P ＜0．01，＊＊ P ＜0．05;与龟羚帕安丸小剂量组对比，▲▲▲P ＜0．01。

组 别 动物数 凋亡细胞数/个 Bcl-2/个 Bax/个Bcl-2/Bax假手术组 8 3．1±0．43 4．23±0．63 4．43±1．77 1．08±0．39模型对照组 8 38．01±3．24＊＊＊ 14．34±2．43＊＊＊ 38．64±4．40＊＊＊ 0．36±0．02＊＊＊美多芭组 8 8．60±0．94### 40．18±2．20### 14．92±2．07### 2．72±0．24###龟羚帕安丸大剂量组 8 7．56±0．86###△＊＊＊▲▲▲ 41．20±5．13###△＊＊▲▲▲ 10．87±2．81###△△△＊＊＊▲▲▲ 3．91±0．59###△△△＊＊＊＊＊▲▲▲龟羚帕安丸中剂量组 8 10．61±1．57### 34．87±5．42### 18．56±2．40### 1．87±0．08###龟羚帕安丸小剂量组 8 18．08±2．36### 26．05±4．22### 30．37±2．83### 0．85±0．07###

3 讨 论

帕金森病属于中医学“颤证”“震颤”的范畴。历代医家认为:该病病机多属本虚标实，本虚是肝肾阴虚，标实为“瘀”“痰”“风”互结、蕴塞脑窍。赵国华教授认为:该病的病理过程初期由实到虚;中期由虚致瘀，表现为虚实夹杂证候;后期为诸脏精血虚损，虚损互为因果，连锁反应过程。他提出了初期宜予以平肝熄风以治标，健脾益气以治本;中期宜豁痰化瘀以治标，滋补肝肾以治本;后期宜补益精血以治损的治疗三法［4］。龟羚帕安丸是治疗帕金森病的经验用方，方中龟板味甘性平，滋阴潜阳，补肾活血;羚羊角味咸性寒，平肝熄风;全蝎味咸性平，祛风止痉通络;威灵仙味辛咸性温，搜风通络;厚朴味苦辛性温，燥湿化痰。诸药合用，共奏滋补肝肾、化痰活血之效。细胞凋亡是在体内外因素的诱导下，由严格和复杂的信号网络调控而发生的自主性细胞有序死亡过程，是机体维持细胞数量稳定的重要手段。细胞凋亡调控异常可能成为某些疾病的重要发病机制。［5］细胞凋亡的机制主要有兴奋性氨基酸中毒、自由基损伤、钙超载、调节基因(Bcl-2、Bax、P53、Fas、TNF-α)等表达失调。Mochizuki 等［6］通过TUNEL检测发现黑质多巴胺能神经元发生细胞凋亡，一些研究表明细胞凋亡参与了帕金森病的发病过程，曹非等［7］的实验研究也证实了这一点。本实验采用TUNEL 方法证实PD 大鼠模型黑质损伤侧呈现典型的黑质凋亡细胞的存在，证实细胞凋亡参与了大鼠帕金森病的发病。黄月等［8］研究表明:6-OHDA 诱导黑质细胞凋亡可能是通过诱导细胞氧化应激反应来调节Bcl-2 家族特别是Bcl-2 和Bax 的表达而导致的。Bc1-2 蛋白家族是哺乳动物细胞凋亡的重要调控因子，包括抗凋亡成分Bcl-2 和Bc1-x1 以及促凋亡成分Bax 等重要蛋白。李立宏等［9］通过实验研究表明:Bcl-2 及Bax 的表达量及Bcl-2/Bax 的变化可以调节细胞死亡和存活间的平衡，决定着凋亡的发生。本实验结果显示:模型对照组与假手术组对比，Bcl-2 及Bax 升高，Bcl-2/Bax 比值降低，但以Bax 升高为主，说明Bcl-2 及Bax 都参与了细胞的凋亡，但以Bax 为主导;龟羚帕安丸大、中、小剂量组和美多芭组与模型对照组对比，Bcl-2 及Bcl-2/Bax 比值都升高，Bax 降低，说明龟羚帕安丸可能主要是提高Bcl-2 的表达及Bcl-2/Bax 比值、抑制Bax 表达，从而具有保护神经细胞的作用。

［1］常学辉，张良芝，李彦杰．龟羚帕安丸配合美多巴片治疗帕金森病30 例疗效观察［J］．新中医，2008，40(6):62－63．

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［3］包新民，舒斯云．大鼠脑立体定位图谱［M］．北京:人民卫生出版社，1991:49－58．

［4］李彦杰，李社宣．赵国华治疗帕金森病经验［J］．光明中医，2004，19(4):42－43．

［5］李桂源．病理生理学［M］．北京:人民卫生出版社，2010:31－42．

［6］Mochizuki H，Goto K，Mori H，et al．Histochemical detection of apoptosis in Parkinson＇s disease［J］．J Neurol Sci，1996，137(2):120－123．

［7］曹非，骆芳，段国安．大鼠帕金森病发病过程中黑质细胞凋亡及其相关基因表达［J］．中国老年学杂志，2007，27(24):2369－2371．

［8］黄月，张善锋，许予明，等．6－羟基多巴胺诱导帕金森病大鼠相关蛋白及mRNA 的表达［J］．郑州大学学报:医学版，2011，46(2):222－225．

［9］李立宏，高国栋，安炜琪，等．帕金森病神经元死亡机制:Bcl-2 与多巴胺诱导PC12 细胞凋亡的相关性研究［J］．现代康复，2001，5(12):44－45．