CD147基因沉默对亲环素A趋化作用及MMP-9表达的影响

路怀志，杜大勇，李雪杰，薛 峰，杨升华，李运田，*

(1南方医科大学第二临床医学院，广州 510515;2解放军第305医院心脏中心;*通讯作者，E-mail:lyt305@126.com)

动脉粥样硬化是炎症驱动的血管病理变化被越来越深刻地认识，在众多的内皮损伤及炎症诱导因子中，过度的氧化应激产物最近被认为是整个炎症瀑布效应中的上游因子之一。亲环素A作为氧化应急介导的主要产物，在动脉粥样硬化斑块单核/巨噬细胞的炎症激活中起着至关重要的作用［1，2］，Kim等［3］研究显示CD147与亲环素A在病变血管壁分布区域相同，多项研究亦表明亲环素 A在诱导MMPs产生及白细胞迁移中有重要作用，在这些过程中亲环素A与CD147可能存在相互作用。本研究拟通过封闭CD147观察其对亲环素趋化及诱导MMP-9生成功能的影响，更好地理解二者之间的关系，寻求动脉粥样硬化治疗新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

CD147shRNA慢病毒载体(BSG－836，上海吉玛基因有限公司);兔单核细胞分离液(天津灏洋);RPMI1640培养基(Hyclone，美国);小牛血清(PAA，奥地利);胰蛋白酶(Hyclone，美国);佛波脂PMA(Sigma，美国);Trizol(Invitrogen，美国);MMP-9酶联免疫试剂盒(R＆D，美国);CD147酶联免疫试剂盒(R＆D，美国);亲环素 A(Sigma，美国);Transwell(Costar，美国)仪器:荧光显微镜(Olympus，日本);ABI9600PCR仪/ABI7900HT定量PCR仪(ABI，美国)。

1.2 诱导外周血单核细胞到巨噬细胞

选用新西兰白兔1只，月龄3个月(北京科宇动物养殖中心提供［合格证号:SCXK京)2007－0003］)，采集兔动脉肝素抗凝血，淋巴细胞分离液密度梯度离心及贴壁培养分离单核细胞，于10%胎牛血清的RPMI1640完全细胞培养液(RPMI1640中含2 mmol/L L－谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)37℃、5%CO2条件下培养，调整细胞密度为1×106/ml。待上述细胞静止12 h后，换入含100 nmol/L PMA的RPMI 1640完全培养基，刺激48 h诱导单核细胞转化为巨噬细胞［4－6］。

1.3 CD147 shRNA慢病毒载体侵染单核/巨噬细胞及CD147检测

将分离并经PMA诱导后的细胞继续在25 cm2的培养瓶内培养，加入4 ml完全培养基，37℃ 5%CO2培养箱培养，待细胞融合度控制在60%－70%。按照预实验中所确定的最佳感染方法和感染复数(multiplicity of infection，MOI)，即聚凝胺 Polybrene5μg/ml，MOI为100。实验分3组，①空白对照组:仅加入 Polybrene 2μl，不做任何处理;②NC对照组:加入空白慢病毒载体0.1 ml+Polybrene 2 μl;③慢病毒干扰组加入CD147 shRNA慢病毒载体0.1 ml+Polybrene 2 μl。每组设3个重复，把细胞放回培养箱孵育72 h。为明确转染水平，我们采取绿色荧光蛋白(green fluorescent protein;GFP)标记慢病毒载体，对空白对照组与慢病毒转染组转染72 h后荧光共聚焦显微镜下显像。采用流式细胞仪检测各组细胞膜表面CD147表达水平，RT-PCR检测CD147 mRNA水平，ELISA检测上清液中游离CD147水平。

1.4 亲环素A趋化实验

采用48孔Transwell室进行趋化实验，滤膜采用5μm孔径的PVPF聚碳酸膜。分别以0.5%BSA的RPMI1640趋化液重悬空白对照组、NC对照组、CD147慢病毒组的巨噬细胞，以5×104细胞/孔注入上室，下室加入0.5%BSA的RPMI1640趋化液+200 ng/ml亲环素A，置于37℃5%CO2孵箱中孵化50 min，取出滤膜去除非细胞面细胞后置入甲醇3 min固定，采用Gimsa染色液染色30 min后自来水冲洗后置于高倍镜下，每孔随机选取5个视野，累积细胞数，算出3个复孔的平均值，作为迁移细胞数。

1.5 干扰CD147-CyPA相互作用对MMP-9表达的影响

按1.2所述细胞分为空白对照组、NC对照组、CD147慢病毒组，每组均设3个重复，分别加入CyPA 200 ng，刺激24 h后吸取上清液，利用ELISA检测各组MMP-9表达水平。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 转染效果

带有GFP标记的阴性对照组及慢病毒干扰组均发出绿色荧光(图1，见第79页)，而空白对照组未见绿色荧光。免疫荧光显示转染率85%左右，说明慢病毒转染成功。

2.2 CD147基因沉默对CD147表达的抑制作用

流式结果显示，CD147 shRNA慢病毒可以显著抑制单核/巨噬细胞 CD147膜分子的表达(P＜0.05)。RT-PCR检测各组CD147 mRNA表达结果显示，各组均可检测到CD147 mRNA表达，组间存在统计学差异(F=51.420，P=0.000);空白对照组和NC对照组CD147 mRNA表达水平无差异(P=0.796);CD147慢病毒组mRNA表达水平与空白对照组相比差异有统计学意义(P=0.000)。ELISA检测各组CD147蛋白表达结果显示，各组均可检测到CD147蛋白，组间存在统计学差异(F=18.423，P=0.000);空白对照组和NC对照组CD147蛋白表达无显著差异(P=0.640);CD147慢病毒组与空白对照组相比CD147蛋白表达量存在统计学差异(P=0.000)。

2.3 细胞趋化实验结果

细胞趋化实验结果显示，在CyPA刺激下CD147慢病毒组迁移细胞数目较NC对照组及空白对照组均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，而空白对照组和NC对照组迁移细胞数差异无统计学意义(P=0.883，见图2)。

表1 三组间单核/巨噬细胞膜CD147平均荧光强度(MFI)、CD147 mRNA及蛋白表达比较(±s)Table 1 Mean fluorescence intensity(MFI)of membrane CD147，expression of CD147 mRNA and protein in monocytes/macrophages in three groups(±s)

表1 三组间单核/巨噬细胞膜CD147平均荧光强度(MFI)、CD147 mRNA及蛋白表达比较(±s)Table 1 Mean fluorescence intensity(MFI)of membrane CD147，expression of CD147 mRNA and protein in monocytes/macrophages in three groups(±s)

与空白对照组及NC对照组比较，*P＜0.01

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图1 荧光显微镜观察CD147-shRNA慢病毒干扰组转染效果 (×200)Figure 1 The transfection results of CD147-shRNA lentivirus under fluorescence microscopy (×200)

图2 在CyPA刺激下三组迁移细胞数变化Figure 2 Changes of migrated cells in three groups after treated with CyPA

2.4 各组MMP-9蛋白表达

空白组和NC对照组MMP-9蛋白表达量无统计学差异(P=0.632);CD147慢病毒组MMP-9蛋白表达与空白对照组及NC对照组比较，差异均有统计学意义(P 分别为0.014，0.003，见表2)。

表2 三组间单核巨噬细胞上清液MMP-9蛋白表达比较(±s)Table 2 Expression of MMP-9 in cell supernatant of monocyte/macrophage in three groups(±s)

表2 三组间单核巨噬细胞上清液MMP-9蛋白表达比较(±s)Table 2 Expression of MMP-9 in cell supernatant of monocyte/macrophage in three groups(±s)

方差不齐，采用Brown-Forsythe法检验，F为对自由度进行校正后的结果，样本均数间的多重比较采用Dunnett’s T3检验;与空白对照组和NC对照组比较，#P＜0.05

CD147慢病毒组 2.00±0.17#

3 讨论

CyPA是一种氧化应激诱导的分泌因子，对内皮细胞/单核细胞/中性粒细胞等有潜在的趋化作用，是一种在免疫相关的心血管疾病中调控内皮细胞功能的旁分泌和自分泌［7］。Seizer等在研究CD34+组细胞分化进展为泡沫细胞中发现CD147/MT1-MMP/MMP-9表达水平上调，CyPA释放到上清液中促进MMP-9分泌，CyPA抑制剂可减少细胞分化过程中MMP-9表达，提示CyPA对MMP-9的表达存在一定的调控［8］。对人AS斑块做免疫组织化学分析显示CD147与CyPA共同存在且分布一致，内皮细胞和巨噬细胞表达CD147和CyPA，二者可能存在相互作用诱导巨噬细胞ERK和核因子－κB信号途径激活导致MMP-9表达水平上升，降解细胞外基质，增加AS斑块不稳定性。

本研究利用CD147 shRNA慢病毒载体转染单核/巨噬细胞，通过封闭CD147来观察二者在MMP-9产生及介导CyPA趋化作用中是否存在相互作用。流式细胞仪显示shRNA转染后单核/巨噬细胞膜表面CD147表达水平较对照组及NC组明显降低，差异有统计学意义，shRNA慢病毒载体侵染是一种能有效降低细胞膜CD147表达水平的手段。对于单核/巨噬细胞趋化实验，空白对照组与CD147慢病毒组趋化细胞数比较有统计学差异，说明CyPA对单核/巨噬细胞有趋化作用，并且与空白对照组相比，NC对照组趋化细胞数没有明显下降，说明转染空载体不影响CyPA对单核/巨噬细胞趋化能力，这些均表明CyPA的趋化作用部分依赖于其和细胞膜CD147的相互作用，封闭CD147可抑制CyPA的趋化效能，CD147在该趋化过程中承担重要角色。通过对细胞培养上清液MMP-9的分析我们同样观察到通过阻断CD147，CyPA促进单核/巨噬细胞分泌MMP-9功能减弱，提示 CyPA通过或部分通过CD147调节MMP-9的产生。

CyPA作为一种氧化应激诱导分泌因子，刺激血管平滑肌细胞迁移/增殖，增加内皮细胞黏附分子的表达，以及促进大量炎性细胞的趋化活性，在心血管疾病的病理生理中有重要作用，同样MMP-9是细胞外基质再吸收、消弱动脉粥样斑块纤维帽导致急性破裂的重要成分，与动脉粥样硬化斑块的稳定性密切相关。在2008年，Piot对58位急性心肌梗死病人进行了环孢素A(可抑制亲环素A)研究，发现静脉应用环孢素A确实可有效减少心肌梗死面积［9］。本研究证实了CD147与CyPA的相互作用在单核/巨噬细胞趋化功能及MMP-9产生中的地位，进一步明确了二者在动脉粥样硬化斑块变化中可能起到的作用，干扰二者相互作用治疗，比如环孢素的口服治疗，可能为动脉粥样硬化及其他疾病的治疗提供新的方向。

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