慢性阻塞性肺疾病患者肺组织和血清HMGB1的表达及与TNF-α和IL-1β的相关性

侯 嘉 马伟荣 刘 洁 段 喻 郑西卫

(宁夏医科大学总医院呼吸内科，宁夏 银川 750004)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种气道慢性炎症性疾病，其发病同多种炎性细胞浸润及相关因子作用密切相关，早期研究集中于白细胞介素(IL)-4、IL-6、干扰素(IFN)-γ等因子，最新报道证实高迁移率族蛋白1(HMGB1)可促进多种晚期炎症因子释放，在炎症反应中扮演着重要作用〔1〕。本研究通过检测COPD患者肺组织及血清中的HMGB1及肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL-1β的表达，分析前者同后两者的相关性，探讨其在COPD炎性反应过程中的作用。

1 资料和方法

1.1一般资料 选择我院2012年4月至2013年4月收治的COPD伴肺癌患者24例作为观察组，其中男14例，女10例，平均年龄(64.3±6.7)岁;选择同期住院的无COPD的肺癌患者24例作为对照组，其中男13例，女11例，平均年龄(62.1±6.4)岁。COPD诊断标准、严重程度分级、稳定期和急性加重期的定义均参考慢性阻塞性肺疾病诊疗规范(2011年版)。两组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。其次，选择我科收治的诊断为COPD急性加重期患者156例，其中男114例，女42例，平均年龄(65.3±9)岁，包括轻中度84例，重度72例;呼吸衰竭80例，无呼吸衰竭76例;行胸部CT诊断有多发肺大泡58例，无肺大泡98例。稳定期COPD患者80例，其中男74例，女6例，平均年龄(57.4±10)岁。选择同期体检证实无肺功能异常的健康人80例为正常组，其中男62例，女18 例，平均年龄(58.2±9)岁。

1.2试剂及仪器 使用兔抗人HMGB1单克隆抗体，二抗即用型免疫组化Elivison plus光谱试剂盒，RNA纯化试剂盒，高容量逆转录酶试剂盒，酶联免疫吸附测定试剂盒，试剂盒均由由Mabtech公司提供。

1.3实验方法 规定实验选用的肺组织距离肺癌病灶＞5 cm，均分为两份，一份立即液氮速冻-70℃冰箱保存，一份常规固定后，行石蜡包埋切片予免疫组化染色。

1.3.1HMGB1表达的检测 采用Elivison二步法检测，以已知阳性非小细胞肺癌(NSCLC)组织为阳性对照，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗为阴性对照，分析表达强度时，于每个切片内收集5个高倍视野HMGB1阳性染色的平均积分光密度值，分析及记录过程用美国Media Cybernetics Incl公司的Image-Pro Plus图像分析系统操作。

1.3.2基因表达的检测 将50～150 mg的肺组织于1 ml Trizol中匀浆，根据试剂盒要求对总RNA提取并纯化。采用TU-1810紫外可见分光光度计检测纯化后的RNA浓度及纯度，之后用高容量逆转录酶试剂盒对其进行逆转录，并采用实时荧光定量PCR扩增引物，反应条件根据试剂盒说明进行，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)对各基因表达进行归一化处理。

1.3.3血清HMGB1、TNF-α、IL-1β 测定 空腹抽静脉血5 ml，在4℃下离心15 min后，将血清分离并置－70℃保存，每次检测前应复苏至室温。按照ELISA法说明书要求对HMGB1、TNF-α、IL-1β测定，试剂盒均由由Mabtech公司提供。

1.4统计学方法 采用SPSS13.0软件进行分析，计量资料采用s表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，多组间比较采用方差分析，相关性分析采用直线回归方程。

2 结果

2.1肺组织中HMGB1蛋白及其mRNA表达 观察组24例标本中22例阳性，阳性率87.5%，对照组24例标本中10例染色阳性，阳性率41.6%(χ2=11.02，P＜0.01)。对照组 HMGB1 蛋白的平均光密度值为 21.9±9.7，显著低于观察组的 46.2±11.5(t=7.91，P＜0.05)。对照组 HMGB1 的 mRNA 转录水平为205±58，显著低于观察组的 205±58，611±88(t=14.68，P＜0.01)。

2.2血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比较 COPD急性加重期和COPD稳定期患者血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平相比对照组明显较高，且COPD急性加重期患者相比稳定期患者明显较高。重度COPD、肺部多发肺大泡患者血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平相比轻中度、肺部无肺大泡患者明显较高。无呼吸衰竭患者的HMGB1明显低于有呼吸衰竭患者，差异显著(t=2.122，P＜0.05)，而呼吸是否衰竭在 TNF-α、IL-1β 水平上无差异。见表1。

2.3相关性分析 对COPD急性加重期患者血清HMGB1与TNF-α、IL-1β水平进行相关性分析表明，两者存在显著相关(r=0.602、0.738，均 P＜0.01)。

表1 血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比较(s)

表1 血清HMGB1、TNF-α、IL-1β水平比较(s)

组别 n HMGB1(μg/L)TNF-α(ng/L)IL-1β(ng/L)80 1.9±1.0 39.2±15.7 14.2±10.6 COPD 稳定期 80 3.1±2.4 72.5±35.9 24.7±15.6 COPD 急性加重期 80 4.8±2.8 101.4±47.8 23.7±18.4 F/P 值 11.842/＜0.05 20.461/＜0.01 6.364/＜0.05轻中度 84 3.6±2.1 89.2±40.5 27.2±16.9重度 72 5.8±3.4 115.6±52.1 39.5±17.1 t/P 值 4.934/0.000 3.557/0.000 4.507/0.000无肺大泡 98 3.8±2.2 92.1±45.9 30.1±17.7多发肺大泡 58 6.8±3.1 123.6±48.8 43.9±18.1 t/P 值 7.045/0.000 4.046/0.000 4.667/0.000无呼吸衰竭 76 4.2±1.9 92.6±46.5 28.5±12.9有呼吸衰竭 80 5.1±3.2 105.3±45.3 31.9±17.2 t/P值正常组2.122/0.035 0.253/0.800 1.391/0.166

3 讨论

HMGB1是具有多种核外生物学功能的非组蛋白，其可高水平表达于急性肺损伤、过敏性肺炎等肺部疾病中，有研究认为该物质具有广泛促炎性细胞因子样作用，通过介导炎症反应，参与了肺部疾病的病理过程。如有研究通过对COPD患者支气管上皮细胞与肺泡灌洗液进行检测后发现，HMGB1表达明显高于无COPD患者及正常对照〔2～4〕。动物实验研究亦证实HMGB1可高表达于COPD组大鼠支气管上皮，且其同气道、肺血管结构的病理变化相一致〔5～8〕。

本研究结果提示HMGB1或许参与到了COPD的气道炎性反应过程中。进一步研究发现，COPD急性加重期患者血清中的HMGB1水平相比COPD稳定期患者较高，重度COPD与肺部多发肺大泡患者相比轻中度与无肺大泡患者较高，无呼吸衰竭患者的HMGB1明显低于有呼吸衰竭患者，可推断血清HMGB1水平或许可反映COPD炎性反应与病理改变的严重程度，同既往研究结果类似〔9〕。本研究结果表明HMGB1与血清TNF-α、IL-1β水平在炎性反应中存在相互关联。有研究发现HMGB1或许可通过IL-1β及晚期糖基化终末产物受体参与到了COPD气道炎症反应及与组织重构中〔10〕。HMGB1同其受体结合后，通过活化核转录因子(NF-κB)，将包括 IL-1β、TNF-α在内的炎性因子大量释放，促进炎性反应，并通过正反馈进一步增加 HMGB1 的分泌，扩大炎性反应范围〔11，12〕。

综上所述，通过研究可以认为，在COPD病程中，HMGB1于肺组织和血清中高度表达，并同TNF-α和IL-1β等多种炎性介质相互作用，扩大炎症反应，促进疾病进展。今后在临床诊疗中，可考虑将HMGB1作为治疗靶点，或许可在控制疾病急性及慢性进展中起到有利作用。

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