全自动图像细胞法、荧光原位杂交法、流式细胞仪对膀胱肿瘤的诊断和意义

顾沈阳 俞俊杰 刘亚东 王业华 杜拥军

膀胱恶性肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，而膀胱尿路上皮癌占膀胱恶性肿瘤的90%以上，随着对膀胱癌遗传学改变的深入研究，人们发现膀胱癌的发生与3、7、17号染色体非整倍体改变及9号染色体p16位点缺失密切相关［1］。目前膀胱镜检查和尿脱落细胞学检查是诊断和监测膀胱尿路上皮癌最重要的2种手段。本研究采用ICM、FISH法和尿细胞检查同时检测40例膀胱尿路上皮癌患者和正常对照组20例非尿路上皮癌的患者尿液，比较3种方法的敏感性和特异性，以及VEGF和VEGFR在膀胱肿瘤组织及正常膀胱粘膜的表达情况。

1 资料与方法

1.1 临床资料

FISH、ICM、尿细胞学检查实验对象:2008年8月至2009年3月我院收治40例膀胱肿瘤初发患者，男性29例，女性11例，年龄45.0～81.0岁，平均年龄68.5岁。肿瘤病理情况按 UICC标准分期:Ta期 2例，T1期8例，T2期 14例，T3期 11例，T4期 5例;按WHO标准进行分级 G1级10例，G2级21例，G3级9例。此40例患者均有病理诊断为膀胱尿路上皮癌。对照组20例非膀胱肿瘤患者，男性10例，女性10例，年龄42.0 ～75.0 岁，平均62.4 岁。

组织VEGF及VEGFR研究对象:病例组:收集我院2004年7月至2006年1月手术切除膀胱癌组织标本45例。标本均经病理检查证实为移行细胞癌。男性28例，女性17例，年龄31～82岁。WHO肿瘤病理分级标准:G1级17例，G2级14例，G3级14例;UICCWHO标准:Tis～T121例，T2～T424例。对照组:10例因良性前列腺增生而行开放手术所获非肿瘤膀胱黏膜。

1.2 实验方法

1.2.1 常规尿细胞学检查 取晨尿200～400 ml，2 000 r/min离心5 min，弃上清。混匀后用细胞离心涂片机制片2张，干燥后加90%酒精固定10 min。显微镜镜检。

1.2.2 FISH法 收集样本(晨尿)约300 ml，分装于50 ml离心管中;2 000 r/min离心10 min，加入5 ml胶原酶B，用力吹打悬浮细胞;预固定;1 000 r/min离心10 min，去上清，室温下缓慢加入5 ml固定液，固定10 min，，重复3次。56℃烤片机上烘烤30 min老化备用。40 μl 20 g/L胃蛋白酶工作液消化玻片10 min，将玻片依次置于4℃预冷的70%乙醇、85%乙醇和100%乙醇中脱水，各3 min。取出玻片，自然晾干。滴加10 μl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖玻片，用橡皮胶封盖玻片边缘。78℃ 5 min共变性，42℃ 过夜杂交。66℃洗涤1 min，0.1%NP-40/2×SSC，室温洗涤1 min，70%乙醇室温3 min。暗处自然干燥玻片，将10～12 μl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片。暗处放置10～20 min，在荧光显微镜下选用无细胞叠加的滤片组观察玻片。

1.2.3 ICM方法 用常规尿细胞学检查方法制作2张细胞涂片，经Thionin-Feulgen染色后，将涂片固定在Olympus BH-2显微镜上，同时用一个高分辨率的数码相机进行扫描。滤色镜波长(600±10)nm，系统分辨率为0.34 μm，单个细胞核的搜索可由一个独特的片段聚焦系统自动完成，对可疑细胞图像进行观察、校对，该系统可搜集近5 000～10 000个细胞和非典型细胞核，获取的细胞图像中包括123种细胞特征参数，如形态特征、染色体分布、行程结构及局部特定特征等参数。搜集细胞核的图像储存在电脑中，根据每个细胞核的123个参数再用分类软件自动进行受检细胞的分类和计数，自动打印DNA倍体分析直方图和细胞点阵分布图。报告分为三部分，第一部分为DNA指数直方图，第二部分为DI指数与细胞核面积坐标图，第三部分为单个细胞核的DI值及其图像。

1.2.4 FCM检测VEGF和VEGFR表达 取手术切除的新鲜膀胱癌组织或非肿瘤膀胱黏膜组织约100 mg。所取标本一部分送病理检查，另一部分制成单细胞悬液，之后进行抗原荧光染色。FCM分析:采用FACSCalibur型流式细胞仪，波长488 nm、功率15 mW氩离子激光器为光源进行单参数分析。检测时每管收集10 000个细胞，CellQuest软件系统分析数据，以FSC和SSC为坐标轴作图，以选定的目标细胞群设门，排除细胞碎片及其他细胞的影响。以PE-IgG1为阴性对照排除背景荧光的干扰，即可得出表达VEGF和VEGFR的阳性细胞数。

1.3 结果判定

1.3.1 常规尿脱落细胞学的结果判定 异常尿脱落细胞镜下示细胞边界清楚，圆形，大小不等。核大，大小不一。偏位，显著异型。胞质较少，嗜碱性，胞核显著异型的小细胞单个散在或聚结。每例患者每天检查1次，连续3天，找到恶性细胞为阳性，3次均未找到病理细胞为阴性。

1.3.2 FISH法的结果判定 正常细胞呈3、7、17号着丝粒及p16位点二倍体，即正常细胞核可见2个红色(p16基因或3号染色体)和2个绿色信号(17或7号染色体)。异常判断标准:每个样本人工在荧光显微镜下观察200个不重叠的细胞核，人工统计信号数目，大于或等于阈值(3.9%)即可判断为该指标异常，如果两个或两个以上指标异常则可以诊断为阳性。

1.3.3 ICM的结果判定 采用DI值即DNA指数判定，在直方图中，DI值有3个或更多的异倍体细胞(DI值＞2.5或5 C，正常人染色体数目定义为二倍体，DNA定量细胞学常用C(content)作为单位来衡量DNA含量。1个C为正常细胞DNA含量的一半)出现即为阳性;如有1个或2个异倍体细胞(DI值＞2.5或5 C)即为怀疑，无DI值＞2.5或5 C的异倍体细胞出现，即为阴性。

1.4 统计学方法

应用SPSS 13.0统计软件分析，两样本率的比较采用四格表资料的χ2检验，等级变量间的相关关系用Spearman等级相关。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FISH、全自动图像细胞法、尿细胞学检查结果

对40例膀胱尿路上皮癌的检测中，全自动图像细胞法分析出25例阳性，总敏感性为62.5%，FISH技术检测出33例阳性，总敏感性为82.5%，常规尿脱落细胞学检测出10例阳性，总敏感性25.0%。FISH技术的敏感性显著高于全自动图像细胞法(ICM)和常规尿细胞学的敏感性(P均＜0.05);全自动图像细胞法敏感性显著高于常规尿细胞学(P＜0.05)。在对20例非尿路上皮癌的3种检测中未发现任何1例阳性。全自动图像细胞法、FISH法和常规尿细胞学检查的特异性都为100%，三者在特异性方面差异无统计学意义(P均＜0.05)。全自动图像细胞法、FISH法和常规尿脱落细胞学检测的敏感性与肿瘤病理分期无相关性(P＞0.05)(表1)，但与WHO分级有显著相关(P＜0.05)(表2);即DNA全自动图像细胞法、FISH法和常规尿脱落细胞学的阳性率随着膀胱尿路上皮肿瘤级别的增高而增高，而与膀胱尿路上皮肿瘤的病理分期无关。

表1 膀胱尿路上皮癌UICC分期与ICM、FISH法和尿细胞学检测结果的关系(例，%)

表2 40例膀胱尿路上皮癌患者WHO分级与ICM、FISH和尿细胞学检测结果的关系(例，%)

2.2 VEGF、VEGFR在膀胱肿瘤组织及正常黏膜组织中的表达

FCM法检测了45例新鲜膀胱癌组织中VEGF、VEGFR的表达水平(表 3)。45例膀胱癌组织中VEGF阳性表达率为(65.19±21.67)%，VEGFR 的阳性表达率为(42.29±16.68)%;非膀胱肿瘤组中VEGF、VEGFR的表达率均较低，两者存在统计学差异(P＜0.01)。在不同病理分期、病理分级中 VEGF、VEGFR表达也不同。VEGF、VEGFR在膀胱癌Ⅲ级中表达率最高，随着肿瘤浸润深度加深，VEGF、VEGFR的表达也随之增强。

表3 FCM法检测VEGF、VEGFR的表达情况(s，%)

表3 FCM法检测VEGF、VEGFR的表达情况(s，%)

注:*为与对照组相比P＜0.01;△为与Ⅰ级、Ⅱ级相比P＜0.01;▲为与Tis～T1相比 P ＜0.01。

阳性率非肿瘤组项目 例数 VEGF阳性率 VEGFR 10 8.32 ±2.86 0.99 ±0.24 BTCC 组 40 65.19 ±21.67* 42.29 ±16.68*病理分级Ⅰ级 15 38.56 ±6.30 25.83 ±2.65Ⅱ级 13 64.76 ±8.66 40.17 ±4.30Ⅲ级 12 87.48±7.05△ 64.39±5.42△浸润深度Tis～ T1 16 45.43 ±11.60 28.07 ±5.37 T2～ T4 24 82.48 ±10.62▲ 54.73 ±12.68▲

3 讨论

膀胱癌有多条染色体的变异，每条染色体异常与肿瘤分期、分级及预后相关性各不相同。近年来，细胞DNA含量定量分析方法广泛应用于肿瘤研究领域，据文献报道结果认为，DNA含量测定可以作为鉴别良恶性肿瘤及判定肿瘤分化程度的一项辅助指标［2-4］。用ICM检测患者尿液中DNA倍体不仅能诊断出病变，而且可以通过分析DNA倍体细胞分布图对肿瘤的恶性程度及预后做出判断，所以在细胞学应用中有一定的优势。本实验结果ICM法的敏感性为62.5%，显著高于常规尿细胞学检查，健康人对照组无1例阳性。ICM法标本制备简单，对标本细胞要求数量不高，并能与细胞形态变化(面积、形态因子、纹理特征等)相结合，在膀胱尿路上皮癌的诊断中有常规尿细胞检查不具备的优越性，但其敏感性不如FISH法高。

从文献报道来看，与膀胱癌发生相关的染色体位点有30多种，其中以p16基因缺失，3、7、17号染色体非整倍性发生概率最高，四者联合的检测率和敏感性最高。其中9号染色体单体性或杂合性缺失在浅表性膀胱肿瘤中最常见，这一异常与膀胱癌的早期发生密切相关，Vysis公司利用FISH法检测出p16基因(定位于9p21);与9号染色体不同17号染色体的杂合性缺失被认为是膀胱癌发生过程中较晚的事件，但与肿瘤的分级和分期有关;7号染色体畸形也常见于膀胱癌，以三倍体多见，多伴有其他染色体改变，有研究表明它的倍数与肿瘤的分期和分级相关;3号染色体异常在膀胱尿路上皮癌约占30%，常与其他染色体异常并存。FISH检测的是染色体的改变，所以可以在临床病理发现前检查到癌变倾向。国内陈顺平等利用FISH对33例浸润性尿路上皮癌患者进行检测发现，FISH诊断敏感性为81.82%、特异性为91.67%。与我们的结果相似［5］。Luo等［6］取 21 例上尿路细胞癌连续病例和10例正常的尿液样本，进行尿细胞学和FISH法检测，FISH法的总体敏感性为85.7%，显著高于尿细胞学检查的23.8%(P=0.0009);FISH法和尿细胞学检查特异性均达到100%。Marin等［7］对74例已经诊断为浅表性膀胱癌的患者分别用FISH法和尿细胞学方法检测尿液样本，通过用FISH法检测染色体3、7、9和17。他们发现两者在对浅表性膀胱癌诊断的敏感性上有着显著性差异(分别是70.3%和35.1%;P＜0.0001)，这种差异同时存在于高分化(分别是52.8%和13.9%;P ＜0.0005)和低分化(分别是 86.8% 和55.3%;P ＜0.0015)肿瘤中;在特异性方面尿细胞学是100%，FISH法是94.7%，尿细胞学怀疑是膀胱癌的FISH法有69%为阳性。

总之，虽然每个实验室的探针的敏感性和特异性各不相同，但是FISH法总体的敏感性显著高于常规尿细胞学和ICM法检查，FISH法的特异性和他们无明显差异。FISH法作为一种新兴技术在膀胱癌早期诊断和预后判断中越来越显示其优越性，具有敏感度高、特异性强和无创性等优点，但是其荧光容易减弱，试剂费用比较高，实验操作流程比较复杂。

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［6］Luo B，Li W，Deng CH，et al.Utility of fluorescence in situ hybridization in the diagnosis of upper urinary tract urothelial carcinoma〔J〕.Cancer Genet Cytogenet，2009，189(2):93-97.

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