血清hMAM对乳腺癌患者新辅助化疗疗效的评估价值

徐海声 张 娟

乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，在目前临床实践中乳腺癌预后评估主要来自于肿瘤的病理分期、腋窝淋巴结转移及激素受体的表达情况，但仍有20%～30%被认为预后良好的乳腺癌患者5年内复发［1］。新辅助化疗是目前局部晚期乳腺癌治疗的标准方案［2］。本研究以乳腺癌组织异性基因hMAM为标志，以RT-PCR技术为基础观察局部晚期乳腺癌患者新辅助化疗前后外周血微转移的变化，探讨其与化疗之间的相关性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择我院2009年12月至2012年12月女性乳腺癌患者45例，年龄36～74岁，平均(47.2±11.4)岁。临床表现为乳腺肿块40例，肿块的最大直径为1.0～4.0 cm;表现为乳头单孔溢血5例。患者32例术前常规病理检查确诊为乳腺癌，13例术中快速病理切片显示为乳腺癌。患者入组条件:①外周血、心肺肝肾功能、尿常规正常。②无过敏体质及免疫缺陷。③所有患者经B超、胸片及骨扫描检查均有远处转移。④所有患者就诊前均接受过其他辅助性治疗。另选健康体检人群20例作为对照。

1.2 治疗方法

患者按照TA方案行新辅助化疗，具体方案:第1天，表阿霉素60 mg/m2，静脉滴注;第2天，多帕菲，100 mg/m2，静脉滴注。化疗21天为1个周期。患者于新辅助化疗前、化疗1个周期后3天及2个周期后3天抽取静脉血测定hMAM mRNA的表达情况。

1.3 RT-PCR 检测

参考hMAM基因库序列进行引物设计，其中引物序列:R为5c-GGGCAGACCTATTA-CATTC-3c，L为5c-GTGCTGG-GATTATAGGTG-3c;GAPDH的引物为5c-CTCAGACACCAT-GGGGAAGGTGA-3c和5c-ATGATCTTGAGGCTGTT-GTCATA-3c。采用Trizol法提取总的RNA，逆转录合成 cDNA第一链。反应条件，MgCl25 mmol/L，10 × 逆转录缓冲液 2 μl，dNTP 1 mmol/L，逆转录酶15 U，使用核酸酶抑制剂0.5 U，Oligo(dT)15 引物 0.5 μg，模板 RNA1 μg，加到无 RNase水至终体积20 μl，42℃下反应1 h，99℃下加热5 min，然后快速冷却到4℃，逆转录所取得的cDNA作为PCR反应模板。逆转录后行PCR扩增，取10 μl的扩增产物行琼脂糖凝胶电泳，紫外透视仪下观察结果。RT-PCR结果根据电泳条带亮度以及内参相对比值进行判断。

1.4 疗效评估

收集乳腺癌患者相关临床病理参数，按照实体瘤近期的疗效评估标准将疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、疾病稳定(SD)、疾病进展(PD)。其中治疗有效为CR+PR，无效为SD+PD，化疗有效的患者在化疗后14～21 d择期手术。

1.5 统计学处理

数据采用SPSS16.0统计学软件处理，资料采用均数±标准差表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，其中P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hMAM mRNA在不同乳腺组织中的表达情况对比

RT-PCR检测显示乳腺癌患者中hMAM mRNA阳性表达率为62.2%(28/45)，显著高于对照组的0，P＜0.05。

2.2 新辅助化疗疗效

本组45例患者均给予新辅助化疗治疗，经过2个周期治疗后，PR为25例，SD为18例，PD 2例。治疗有效率为55.6%。新辅助化疗前后外周血hMAM表达变化显示，化疗1周、2周后PR组的hMAM表达指数显著低于SD+PD组，差异有统计学意义，P＜0.05，表明乳腺癌患者hMAM表达越高预后越差，见表1。

表1 新辅助化疗前后外周血hMAM表达变化情况

2.3 乳腺癌外周血hMAM阳性表达与临床病理特征相关性

乳腺癌外周血hMAM阳性表达与临床病理特征的相关性研究显示，hMAM阳性表达与TNN分期及ER的阳性表达密切相关，见表2。

表2 乳腺癌外周血hMAM阳性表达与临床病理特征相关性

3 讨论

新辅助化疗早期作为失去手术机会的局部进展期乳腺癌患者的一种替代治疗手段，部分患者通过新辅助化疗充分降低了分期，使手术切除变成可能。乳腺癌患者死亡的主要原因为淋巴结转移。乳腺癌发生淋巴结转移前就会发生血行转移。欧洲一项涉及4 703例乳腺癌患者的荟萃分析显示，最初诊断时微转移的发现率高达30.6%，表明乳腺癌的血液转移要早于淋巴结转移［3］。微转移的发生提示乳腺癌患者预后不良。

外周血是一个理想的微转移检测标本，从技术角度上说外周血采血相对简单方便、容易接受、无创伤，而且可以反复采集，实现动态了解肿瘤细胞变化的目的［4］。外周血检测到肿瘤扩散能够预示着早期发生全身转移的可能性，直接影响患者疗效及预后。转移肿瘤细胞特异性基因标志物检测能够为早期治疗和筛查微转移提供重要的参考［5］。外周血检测到的乳腺组织粘附蛋白及特异性蛋白能够早期发现乳腺癌的播散细胞，有学者采用MUC-1、CK19等多种分子标志物以期检测出乳腺癌的播散细胞，并分析其阳性表达对乳腺癌复发的预测效果 ，然而这些标志物表达多特异性不高。

hMAM是Fleming和Watson利用差式筛选及cDNA末端扩增技术分离到的新型乳腺组织特异性的基因，hMAM mRNA在正常乳腺上皮细胞中表达较低，在乳腺癌组织中表达相对较高［8］。

Ignatiadis等［9］采用 RT-PCR技术对早期乳腺癌患者中的HER-2、CK19、hMAM mRNA表达进行检测，结果显示辅助化疗前外周血hMAM mRNA阳性表达的乳腺癌患者无病生存期较短。本组研究RT-PCR结果显示健康志愿者血清中未检测到hMAM mRNA。而乳腺癌患者中hMAM mRNA阳性表达占62.2%，表明阳性表达hMAM mRNA在乳腺癌患者中存在着高表达。且病理相关性研究中显示hMAM阳性表达与TNN分期及ER的阳性表达密切相关。在新辅助化疗的相关性研究当中，本组研究发现化疗1周、2周后PR组的hMAM表达指数显著低于SD+PD组，结果对比有统计学差异，P＜0.05，表明乳腺癌患者预后越差，hMAM表达越高。

综上所述，hMAM mRNA在乳腺癌患者外周血中有特异性的表达，为临床检测及制定乳腺癌微转移的治疗路径提供了参考，具有重要的临床指导价值。

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