p-ATM、p-p53及p-p21因子与进展期胃癌化疗疗效及预后的关系

洪成雨 郑 建 李 婷

代谢活动和环境因素(如紫外线)对机体的每个细胞每天的分子损害500，000处之多。DNA损伤反应(DNA damage response，DDR)是一个高度保守的信号感应过程，其必须快速频繁的运行，来修复DNA结构上的任何错误之处。DDR信号通路被看作是机体的一道抗癌屏障，如通路中有信号分子发生突变或调控异常，细胞染色体的不稳定性将会增加，自稳失衡，增殖失控，促成肿瘤的发生。我们通过研究其通路中p-ATM、p-p53、p21信号分子与胃癌化疗疗效的相关性，为DNA损伤在进展期胃癌发生发展进程中可能存在的作用提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取2010年1月至2011年10月我院收治并经病理学检查证实为进展期胃癌患者52例，其中男性28例，女性24例，年龄 42～76岁，平均(58.3±7.2)岁。患者均行胃癌根治术，按WHO制定的标准进行术后病理组织学分型:高分化腺癌9例，中分化腺癌13例，低分化腺癌22例，黏液腺癌8例。纳入标准:未发生肺脏、肝脏、脑、骨等器官的远处转移;既往未接受过抗肿瘤治疗以及化疗;无化疗和手术禁忌症;病史资料完整;术后均采用FOLFOX方案化疗4个周期。

1.2 主要试剂

p-ATM为鼠抗人单克隆抗体、p-p53为兔抗人多克隆抗体，均购自美国Cell Signaling Technology公司，p21为兔抗人多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，广谱S-P试剂购自福建迈新技术公司。

1.3 治疗方法

入选患者均采用FOLFOX方案化疗:奥沙利铂130 mg/m2，第1天，静脉滴注3 h;亚叶酸钙200 mg/m2，第1～2天，静脉滴注 1 h;5-氟尿嘧啶，2400 mg/m2，静脉持续泵入46 h。3周为1个周期，完成4个周期后判定疗效。按WHO实体瘤近期客观疗效标准进行疗效评估，分为未进展和进展，未进展为治疗有效，进展为治疗无效。记录并观察所有患者从首次化疗至病情进展或死亡的时间。随访截止日期为2012年11月10日。

1.4 免疫组化染色

所有标本均经10%福尔马林液固定，常规石蜡包埋组织并切片，HE染色，采用免疫组化SP法，正常羊血清室温封闭10 min，加鼠抗人一抗于4℃过夜，PBS冲洗后加兔抗鼠二抗于室温下作用30 min，PBS冲洗3×5 min。DAB显色反应，自来水充分冲洗终止反应，冲洗后苏木精复染、脱水、封固。用已知的阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5 结果判断方法

p-ATM、p-p53及p21蛋白阳性着色均分布于细胞核，每张切片选择10个典型的高倍视野(×400)，计数至少1000个细胞，结果以阳性细胞百分比计算，阳性细胞率≥10%为阳性(+)，＜10%为阴性(－)。

1.6 统计分析

应用SPSS 11.5统计软件进行统计学分析。采用t检验、χ2检验、确切概率法及Pearson相关分析法，采用Kapan-Meier生存分析法分析无病生存期。

2 结果

2.1 p-ATM、p-p53及p21表达与胃癌临床病理特征的关系

p-ATM阳性着色分布癌细胞核，52例胃癌组织中p-ATM阳性表达率为36.54%，p-ATM表达与患者性别、年龄无关(P＞0.05)，p-ATM表达与胃癌病理类型、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关(P＜0.05)。p-p53阳性着色分布于癌细胞核，52例胃癌组织中阳性表达率为61.54%，p-p53表达与患者性别、年龄、病理类型、浸润深度无关(P＞0.05)，与淋巴结转移、TNM分期显著相关(P＜0.05)。p21阳性着色分布于癌细胞核，52例胃癌组织中其阳性表达率为36.54%，其表达与患者性别、年龄、浸润深度无关(P＞0.05)，而与其病理类型、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期显著相关(P＜0.05)，见表1。

表1 p-ATM、p-p53及p21表达与胃癌临床病理特征的关系(例，%)

2.2 p-ATM、p-p53及p21表达与其疗效的关系

52例初治进展期胃癌患者化疗4个疗程后进行观察，有效34例，无效18例，p-ATM阳性表达者治疗有效率为84.21%，p-ATM阴性表达者治疗有效率为51.52%，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)。pp53阳性表达者治疗有效率为56.25%，p-p53阴性表达者治疗有效率为80.00%，两者比较无统计学意义(P＞0.05)。p21阳性表达者治疗有效率为78.95%，p21阴性表达者治疗有效率为57.58%，两者比较无统计学意义(P ＞0.05)，见表2。

表2 p-ATM、p-p53和p21表达与胃癌患者疗效的关系/例

2.3 p-ATM、p-p53及p21表达与胃癌患者无进展生存期的关系

52例进展期胃癌患者中位PFS为7个月，其中p-ATM阴性者中位PFS为6个月，p-ATM阳性者中位PFS为8个月，两者PFS比较差异有统计学意义(P＜0.01)，见图1a。p-p53阴性者中位PFS为8个月，pp53阳性者中位PFS为7个月，两者PFS比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图1b。p21阴性者中位PFS为6个月，p21阳性者中位PFS为8个月，两者PFS比较差异有统计学意义(P＜0.01)，见图1c。

图1 p-ATM、p-p53、p21表达对化疗PFS的影响

2.4 p-ATM、p-p53及p21表达间的相关性

本组中p-ATM表达与p21表达呈正相关，p21表达与p-p53表达呈负相关(P＜0.05)，p-ATM表达与p-p53表达无相关性。

3 讨论

3.1 磷酸化蛋白的意义

DNA损伤是指在复制过程中DNA核苷酸序列发生了永久性改变，并导致了遗传特征改变的现象。损伤类型包括:碱基结构的改变、分子间的交联、单链断裂、双链断裂(double-strand breaks，DSBs)［1-3］。p-ATM(Phospho-ATM(ser1981)protein)是Ser1981磷酸化的ATM(ataxia telangiectasia mutated kinase)蛋白，ATM主要感应和识别各种内外源性诱变因子造成的DSBs［4-5］。DSBs能够促使ATM发生自动磷酸化进而快速激活ATM 激酶［6-7］，所以p-ATM(ser1981)的表达水平与DSBs损伤的情况具有相关性。p-p53(Phosphop53(ser15)protein)是Ser15磷酸化的p53蛋白。当细胞应激或受损时p53被活化，为DNA损伤修复赢得时间，修复失败则促进细胞凋亡，避免细胞发生恶性转化。p53蛋白在DDR中作为调控分子，在损伤修复和凋亡诱导途径中均发挥重要作用。p21基因与细胞凋亡关系密切，p21在DNA损伤时，使生长周期停滞，DNA 修复，保护细胞免受凋亡［8］。

3.2 磷酸化蛋白表达与胃癌化疗疗效的相关性

我们主要通过免疫组化方法对p-ATM、p-p53、p21与胃癌化疗疗效的相关性的研究，探讨三者在DNA损伤修复过程中可能存在的作用。本实验室研究发现，p-ATM、p-p53和p21在胃癌组织中的阳性表达率分别为36.54%、61.54%和36.54%。经 Pearson 相关分析结果显示，p-ATM表达与p21表达呈正相关，p21表达与p-p53表达呈负相关，p-ATM与p-p53表达无相关性。DNA损伤后激活ATM激酶，ATM快速磷酸化p53，继而通过p21诱导G1期阻滞。

3.3 磷酸化蛋白表达与临床病理特征的相关性

我们的实验数据显示，化疗后DNA损伤情况严重，p-ATM与p21高表达，p-p53表达较弱。提示，细胞中可能存在一条通路，其不依赖于p53直接由ATM介导的 p21活化的快速反应［9-10］。p-ATM、p-p53和p21的阳性率与患者年龄、性别无明显相关性(P＞0.05)，而p-ATM阳性着色位于癌细胞核与肿瘤的浸润深度、组织学分化程度、胃癌的淋巴结转移及TNM分期有显著相关性(P＜0.05)。p-ATM与p21在低分化腺癌类型、浸润未及浆膜、无淋巴结转移、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期)高表达，p21阳性着色位于癌细胞核中。p-p53阳性着色位于癌细胞核中，且随着淋巴结转移以及TNM分期的增加，表达阳性率也明显升高。说明炎症浸润程度与DNA损伤存在相关性，炎症可能加速癌变进程［11］。本实验52位患者均行4个疗程FOLFOX方案化疗，在此基础上检测p-ATM、p-p53和p21与进展期胃癌化疗疗效的关系。本研究观察发现，化疗后临床疗效有效者34例，无效者18例，胃癌组织中p-ATM和p21在阳性表达初治进展期胃癌患者的治疗有效率均显著高于阴性表达者治疗有效率，p-p53阴性表达者治疗有效率为80.00%，p-p53在阴性表达初治进展期胃癌患者的治疗有效率均显著高于阳性表达者。人类肿瘤组织中常伴随DSBs的积累［12］，而p-ATM(ser1981)的表达水平可反映DSBs损伤水平。由此推论，在进展期胃癌中也存在DNA DSBs损伤的积累，且ATM和p21蛋白的活化促使了DNA损伤的修复。

3.4 磷酸化蛋白表达与化疗后生存期的相关性

本组研究中，中位生存期为7个月，其中p-ATM和p21阴性者中位PFS为6个月，ATM阳性者中位PFS为8个月。经单因素Kaplan-Meier生存分析，结果显示p-ATM和p21阳性者的PFS优于阴性者，差别有统计学意义(P＜0.01);而p-p53阴性者的PFS优于阳性者(P＜0.05)。推测，在胃癌患者化疗后DNA发生损伤，p-ATM和p21可使受损DNA得到修复，再加上综合治疗来提高患者的生存期。

综上所述，本研究得出如下结论:ATM、p53、p21信号通路对肿瘤的发生、发展可能具有极为重要的作用，可进一步深入研究。

［1］Pandita TK，Richardson C.Chromatin remodeling finds its place in the DNA double-strand break response〔J〕.Nucleic Acids Res，2009，37(5):1363-1377.

［2］Khanna KK，Jackson SP.DNA double-strand breaks:signaling，repair and the cancer connection〔J〕.Nat Genet，2001，27(3):247-254.

［3］朱 虹，缪泽鸿，丁 健，等.ATM、ATR和DNA损伤介导的细胞周期阻滞〔J〕.生命科学，2007，19(2):139-148.

［4］Rai P，Onder TT，Young JJ，et al.Continuous elimination of oxidized nucleotides is necessary to prevent rapid onset of cellular senescence〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(1):169-174.

［5］Shrivastav M，De Haro LP，Nickoloff JA.Regulation of DNA double-strand break repair pathway choice〔J〕.Cell Res，2008，18(1):134-147.

［6］Bakkenist CJ，Kastan MB.DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation〔J〕.Nature，2003，421(6922):499-506.

［7］Bhatti S，Kozlov S，Farooqi AA，et al.ATM protein kinase:the linchpin of cellular defenses to stress〔J〕.Cell Mol Life Sci，2011，68(18):2977-3006.

［8］闫海龙，龚勇珍.氧化应激及p16和P53/P21与细胞衰老关系的研究进展〔J〕.医学综述，2011，17(5):682-685.

［9］Agami R，Bernards R.Distinct initiation and maintenance mechanisms cooperate to induce G1cell cycle arrest in response to DNA damage〔J〕.Cell，2000，102(1):55-66.

［10］罗加林，曹建平，朱 巍，等.ATM与辐射激活的磷酸化P53、P21 蛋白的相互作用〔J〕.癌症，2005，24(9):1059-1063.

［11］张国红，苏 敏，田东萍，等.慢性炎症介导的基底膜改变在食管上皮癌变中的作用〔J〕.癌症，2005，24(9):1071-1075.

［12］Wang X，Zeng L，Wang J，et al.A positive role for c-Abl in Atm and Atr activation in DNA damage response〔J〕.Cell Death Differ，2011，18(1):5-15.