脑胶质瘤IDH1基因突变与核干细胞因子表达的相关性分析

寿记新 管海博 程 森

郑州大学第五附属医院神经外科 郑州 450052

胶质瘤（glioma）又称神经胶质细胞瘤，多见于成年人，是起源于神经外胚层的肿瘤，核干细胞因子（核－stemin，NS）是一种对细胞继续增殖起关键作用的鸟嘌呤核苷酸结合蛋白［1］，且发现 NS蛋白在多种肿瘤组织中高表达［2－3］。异柠檬酸脱氢酶（IDH）是一种限速酶，可为细胞新陈代谢供应能量、合成前体物质［4］。而近几年，Parsons等［5］通过对胶质母细胞瘤（GBM）标本进行研究，发现了其突变位点，且发现此突变与生存率的关系，为进一步研究胶质瘤的治疗打下了坚实的理论基础。本文主要分析胶质瘤中IDH1基因突变与胶质瘤NS表达的相关性，旨在进一步阐明二者与胶质瘤的发生、发展与预后的关系。

1 材料与方法

1.1材料选取我院神经外科2010－03—2013－03手术切除的部分胶质瘤标本58例，其中原发病例29例为原发组，按照WHO（2000）标准进行病理分级，Ⅱ级10例，Ⅲ级11例，Ⅳ级8例。复发病例29例为复发组，Ⅱ级6例，Ⅲ级10例，Ⅳ级13例。用相应方法分别检测样本的IDH1基因多态性变化与NS表达；所有标本均由本院病理科医师提供。

1.2 PCR检测IDH1基因多态性

1.2.1 DNA：用上海酶联试剂盒检测测定中心DNA提取试剂盒，按说明书提取DNA，核酸定量仪测定DNA浓度。

1.2.2 PCR 扩增引物的设计与合成：序列为：5＇－AGCTATGTGTTGAGATGGACGCCTATTTG 和 3＇－CGACTTGCCACCAACGACCAAGTC。合成步骤：95℃预变性10～12 min；用 Touchdown PCR，95℃变性55s，56℃退火1min，72℃延伸1～2min，共循环15次；94℃变性50s，58℃退火1 min，72℃延伸1min，共循环25次，最后于72℃延伸10min。

1.2.3 测序反应后纯化及基因测序：PCR产物用北京方程科技有限公司提供PCR纯化试剂盒进行纯化。纯化后的产物经北京美科美生物科技有限公司提供的DNA自动测序仪（ABI3730型遗传分析仪）电泳。

1.2.4 结果分析：用DNA序列分析5.1自动分析原始测序数据，样本序列采用相应DNA软件与标准序列进行对比，察看样品基因序列的变化。

1.3 NS表达检测首先标本组织经生理盐水冲刷干净、固定、脱水处置，其次经二甲苯透后，石蜡包埋，做成4μm厚度切片。采用免疫组织化学法检测NS蛋白。鼠抗羊IgG购自郑州百基生物科技有限公司，SABC免疫组化染色试剂盒购自上海蓝基生物有限公司，严格按照说明书进行使用，最后镜检。用PBS作为阴性对照，而阳性对照采用NS蛋白阳性的子宫内膜癌组织切片。

2 结果

2.1胶质瘤中IDHl的突变情况

2.1.1 直接基因测序：58例胶质瘤标本中，共30例发生IDHl突变，突变类型均为R132H型。原发标本组和复发组发生IDH1基因突变率见表1。经统计学软件分析：在原发组中Ⅳ级胶质瘤发生突变率低于Ⅱ、Ⅲ 级，差异有统计学意义（P＜0.05）；复发标本组中Ⅳ级胶质瘤发生率高于Ⅱ、Ⅲ级，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 胶质瘤标本中不同病例级别IDH1基因突变率比较 ［n（%）］

2.1.2 原发胶质瘤中IDHl突变与NS表达的关系：NS检测显示不同WHO分级的原发胶质瘤标本中NS阳性的表达率分别为Ⅱ级（30.00±7.50）%、Ⅲ级（45.45±8.34）%和IV级（62.50±14.01）%。经统计学软件分析表明NS阳性表达与肿瘤的病理分级有正相关性（r＝0.528，P＝0.006）。伴IDHl突变的肿瘤标本 NS阳性表达率（36.28±13.17）%较IDHl野生型NS表达率（45.34±4.81）%增多，差异有统计学意义（t＝3.082，P＝0.027）。

2.1.3 复发胶质瘤中IDHl突变与NS表达的关系：NS检测显示不同WHO分级的复发胶质瘤标本中NS阳性的表达率分别为Ⅱ级（50.00±16.23）%、Ⅲ级（70.00±13.48）%和IV级（84.61±9.52）%。经统计学软件分析表明NS阳性表达与肿瘤的病理分级有正相关性（r＝0.614，P＝0.0039）。与原发肿瘤（43.52±15.36）%比较，复发肿瘤中的 NS阳性表达率（78.23±15.03）%明显增高，差异有统计学意义（t＝15.271，P＝0.008）。伴有IDHl突变的复发胶质瘤标本中NS阳性表达率（79.32±3.55）%较IDHI野生型NS表达率（50.79±5.14）%增多，差异有统计学意义（t＝2.384，P＝0.01）。

3 讨论

胶质瘤是中枢神经系统中较为常见的肿瘤，通过临床观察大多数患者预后不佳［6］。核干细胞因子是美国学者McK－ay和Tasi于2002年在成年鼠的脑干细胞中发现的新蛋白［7］；IDH虽是人们比较熟悉的蛋白，但研究人员最近才发现IDH基因的突变在胶质瘤发生发展过程中可能起到非常重要的作用。然而，在异柠檬酸脱氢酶l与核干细胞因子间是否存在联系，此联系在胶质瘤形成过程中起着什么样的作用，目前研究仍较少，笔者通过此实验探讨了IDHl多态性与NS表达的联系。经过分析得在原发性胶质瘤和复发性胶质瘤中均可出现较高频率的IDH1突变，与以往研究结果相同［8］，且可增强胶质瘤中核干细胞因子的表达。

本文结果进一步证实了NS在胶质瘤中表达的存在，且随着病理级别的升高，肿瘤内的NS表达比例升高，这也说明高病理级别的胶质瘤细胞具有较强的增殖能力与侵袭性。通过分析结果可以发现肿瘤中的IDHl突变与肿瘤病理分级有相关性，与以往研究相同［9］。但突变可出现良好预后的原因及机制仍未能完全解释，而要想更全面明确胶质瘤的发生发展机制，并将其理论应用于临床诊治胶质瘤的工作中，还需大样本量的实验室研究与临床研究。

［1］Liu SJ，Gai ZW，Liu YJ，et al.Role of nucleostemin in growth regulation of gastric cancer，liver cancer and other malignancies［J］.World J Gastroenterol，2004，10（9）：1 246－1 248.

［2］Singh SK，Hawkin S，Clarke ID，et al.Identification of human brain tumour initiating cells［J］.Nature，2004，432（7015）：396－399.

［3］Ricci－Vitiani L，Lombardi DG，Pilozzi E，et al.Identicication and expansion of human colon cancer initiating cells［J］.Nature，2007，445（7123）：111－116.

［4］Dang L，White DW，Gross S，et al.Cancer associated IDH1mutations produce 2？hydroxyglutarate［J］.Nature，2009，46，（2）：739－744.

［5］Parsons DW，Jones S，Zhang X，et al.An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme［J］.Science，2008，321（625）：1 807－1 812.

［6］韩松，董韬，于春泳 .MCT1CD147在人胶质瘤中的表达与预后的相关性［J］.中国实用神经疾病杂志，2014，17（1）：1－3.

［7］Tsai RY，McKay RD.A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells［J］.Gene Dev，2002，16（23）：2 991－3 003.

［8］王继超，郑勇等 .胶质瘤IDHl基因突变与胶质瘤干细胞相关基因表达的相关性研究［J］.中华神经医学杂志，2012，11（4）：372－375.

［9］Yan H，Parsons DW，Jin G，et a1.IDHl and IDH2mutations in gliomas［J］.N Engl J Med，2009，360（8）：765－773.